T/JLNCP 4302-2025 常见动物源性成分检测 微滴式数字PCR法

以下是该标准文件主要内容的详细总结：

​​标准基本信息​​

1. ​​标准编号​​：T/JLNCP 4302-2025
2. ​​名称​​：常见动物源性成分检测微滴式数字PCR法
3. ​​发布与实施​​：2025-02-18发布，2025-03-18实施
4. ​​归口单位​​：吉林省农产品质量安全学会
5. ​​起草单位​​：吉林省农业科学院（中国农业科技东北创新中心）

​​一、适用范围​​

• ​​检测对象​​：肉及肉制品中的动物源性成分，包括：
  • ​​牛​​（黄牛、牦牛）
  • ​​羊​​（绵羊、山羊）
  • ​​猪​​（家猪、野猪）
  • ​​鸡​​（原鸡、野鸡）
  • ​​鸭​​
• ​​适用样品​​：鲜（冻）肌肉组织、精加工肉制品。
• ​​检测类型​​：​​定性检测​​（判定是否含有目标物种成分）。

​​二、检测原理​​

1. ​​技术基础​​：微滴式数字PCR（ddPCR）
   • 将PCR反应体系分割成数万个"油包水"微滴（微反应体系），每个微滴独立扩增。
   • 通过荧光信号统计阳性微滴数量，结合泊松分布计算靶基因拷贝数浓度。
2. ​​靶基因选择​​：
   • ​​内参基因​​：18S rRNA（通用动物源性成分验证）
   • ​​物种特异性基因​​：

     物种	靶基因
     牛	β-actin
     羊	RPA1
     猪	β-actin
     鸡	TGFB3
     鸭	IL-2

​​三、关键试剂与材料​​

1. ​​DNA提取​​：
   • 试剂盒：经验证的动物DNA提取试剂盒
   • 辅助试剂：PBS缓冲液、蛋白酶K（20 mg/mL）、盐酸溶液（1 mol/L）
2. ​​ddPCR扩增​​：
   • 预混试剂：含镁离子、dNTPs、热启动Taq酶的数字PCR专用预混液
   • ​​引物/探针​​：
     • 探针标记：5'端FAM/HEX等荧光基团，3'端TAMRA/BHQ1等淬灭基团
     • 序列详见表1（标准原文表1）

​​四、操作步骤​​

（1）样品前处理

• ​​取样​​：按GB/T 9695.19执行
• ​​制备​​：绞碎混匀成肉糜

（2）DNA提取

• 称取10 mg肉糜 → 加PBS缓冲液和蛋白酶K → 56℃水浴2h → 离心取上清 → 试剂盒提取DNA
• ​​质控要求​​：
  • DNA浓度：1–100 ng/μL
  • 纯度：A260/A280=1.8–2.0

（3）ddPCR扩增

• ​​反应体系​​（20 μL）：

  组分	体积/终浓度
  ddPCR预混液（2×）	10 μL（1×）
  上游/下游引物（10 μM）	各1.0 μL（0.5 μM）
  探针（10 μM）	0.5 μL（0.25 μM）
  DNA模板（50 mg/L）	2.0 μL
  灭菌水	补足至20 μL

• ​​扩增程序​​：

  95℃ 5 min → [94℃ 30s → 58℃ 60s] ×44循环 → 98℃ 10 min → 4℃保存  

（4）对照设置

• ​​阳性对照​​：目标物种标准物质
• ​​阴性对照​​：非目标物种样品
• ​​空白对照​​：灭菌水替代DNA模板

​​五、结果判定​​

1. ​​内参基因（18S rRNA）未检出​​
   → 报告："未检出动物源性成分"（阴性）
2. ​​内参基因检出 + 目标基因未检出​​
   → 报告："未检出目标动物源性成分"（阴性）
3. ​​内参基因 + 目标基因均检出​​
   → 报告："检出目标动物源性成分"（阳性）

​​六、方法性能指标​​

​​七、质量保证​​

1. ​​防污染措施​​：按GB/T 27403执行（独立分区操作、耗材灭菌等）
2. ​​有效性验证​​：
   • 阳性对照：靶基因明显扩增（荧光信号≥阈值）
   • 阴性/空白对照：无扩增（信号＜阈值）
   • 否则需重检

​​八、附录内容​​

• ​​附录A​​：提供牛（β-actin）、羊（RPA1）、猪（β-actin）、鸡（TGFB3）、鸭（IL-2）的靶基因参考序列（5'→3'方向）。

​​核心意义​​

该标准建立了基于ddPCR技术的肉制品动物成分检测方法，具有​​高灵敏度​​（可检测单拷贝基因）、​​强特异性​​（避免交叉反应）、​​精确定性​​能力，适用于市场监管、食品安全检测及物种掺假鉴定场景。