T/GRHA 0001-2024 基于FFPE 样本的非小细胞肺癌相关基因突变高通量测序检测方法

ICS 11.020
CCS C 50
广东省呼吸与健康学会团体标准
T/GRHA 0001—2024
基于FFPE 样本的非小细胞肺癌相关基因突变高通量测序检测方法
The high-throughput sequencing method for detecting non-small cell lungcancer-associated gene mutations based on FFPE samples
2024 - 12 - 26 发布2025 - 01 - 01 实施
广东省呼吸与健康学会 发布

目次
前言.................................................................................. II
1 范围................................................................................ 1
2 规范性引用文件...................................................................... 1
3 术语和定义.......................................................................... 1
4 缩略语.............................................................................. 3
5 实验室分区、仪器设备及试剂.......................................................... 3
6 检测内容和范围...................................................................... 4
7 样本采集、保存及运输................................................................ 6
8 检测实验步骤........................................................................ 6
9 数据处理和分析...................................................................... 8
10 性能确认........................................................................... 9
11 质量控制.......................................................................... 10
附录A（规范性） 采样方式和注意事项以及FFPE 样本准备、保存与运输条件..................12
附录B（资料性） 申请单模板与送检须知示例.............................................15
参考文献.............................................................................. 17
T/GRHA 0001—2024
II
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由广东省呼吸与健康学会提出。
本文件由广东省呼吸与健康学会归口。
本文件起草单位：广州金域医学检验集团股份有限公司、广州呼吸健康研究院、中山大学附属第一
医院、暨南大学附属第一医院、广州金域医学检验中心有限公司、广州迈景基因医学科技有限公司、哈
尔滨医科大学附属第四医院、北京大学深圳医院、广东省第二人民医院、中国人民解放军第九六二医院、
南京世和基因生物技术股份有限公司、北京吉因加、深圳市第二人民医院、延边大学附属医院、长沙市
中医医院、常德市第一人民医院、中国航天科工集团七三一医院、中国医科大学附属第一医院、大连市
理工大学附属中心医院、朝阳市第二医院、广州中医药大学深圳医院（福田）、河南科技大学第一附属
医院、齐齐哈尔医学院附属第三医院、互助土族自治县中医院、云南曲靖市第一人民医院、云南省昭通
市中医医院、德宏州人民医院、武汉大学中南医院、台州市中心医院、洛阳市中心医院、烟台毓璜顶医
院、安阳市人民医院、郑州市第三人民医院（郑州市肿瘤医院）、驻马店市第一人民医院、贵州省人民
医院、贵州省黔南州人民医院、贵州市第二人民医院、六盘水市人民医院、黔西南布依族自治州人民医
院、都匀市人民医院。
本文件主要起草人：祁德波、周承志、柯尊富、陆元志、蔡小强、常凤启、牟文博、程雅婷、邓泱
泱、李梦真、才旭、路德娟、吴晓红、栾嵩、孙瑞琳、杨家盛、赵守焱、申健、张秀艳、易玉婷、王佳
威、莫南勋、刘向前、李维、张敏、苏炜欣、张松男、孙妲、邹孔军、杜维、刘庆、成尚涛、相科羽、
吴志军、闵先军、孔德磊、汪洋、姚冬梅、张智伟、毛毅敏、石寒冰、牟海军、姜云飞、石大泉、白文
琴、李宏伟、付玉东、鲜昌毅、钱俊、余露、陈保富、卢洪胜、黄建伟、赵琪、刘杰、王永亮陈露、
孔天东、李林野、彭春红、叶贤伟、吴熙、方银、黎莉、肖霄、梁伟、朱文煜、龙秀、李林、孔伟英、
琚桂平。
T/GRHA 0001—2024
1
基于FFPE 样本的非小细胞肺癌
相关基因突变高通量测序检测方法
1 范围
本文件规定了采用高通量测序技术对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本进行非小细胞肺癌
（NSCLC）相关基因突变的检测方法和操作流程，以及性能确认和质量控制等。
本文件适用于临床医学领域中涉及高通量基因测序项目研发和应用的医疗卫生机构、第三方检测机
构、技术研发企业等。
本文件适用于拟接受靶向治疗的浸润性腺癌或含腺癌成分的NSCLC患者，包括IB-IIIA期术后和IIIB
期以上晚期患者。经活检组织病理学确诊为鳞癌的晚期NSCLC患者携带可靶向的驱动基因机率较低，可
选择检测。使用来源于其肿瘤组织的FFPE样本，检测具有靶向治疗药物的驱动基因变异并作为用药指导。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T 30989—2014 高通量基因测序技术规程
GB/T 35890—2018 高通量测序数据序列格式规范
GB/T 42216.3—2022/ISO 20166—3:2018 分子体外诊断检验福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前
过程的规范
T/GDPMAA 0011—2022 医疗机构分子病理实验室建设规范
T/GDPMAA 0012—2023 高通量基因测序项目分类
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
高通量测序High-throughput sequencing
又称为二代测序（Next-generation sequencing，NGS），能够一次对大量核酸分子进行平行序列
测定，通常一次测序反应能产出数百万至数亿条核酸片段的测序数据。
[来源：GB/T 30989—2014，定义3.19，《高通量基因测序技术规程》，参考并修改]
3.2
非小细胞肺癌Non-small cell lung cancer; NSCLC
非小细胞肺癌（NSCLC）是除小细胞肺癌（SCLC）以外、所有来源于肺上皮的各种类型癌症的集合
体；常见类型有鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。NSCLC的发生率占肺癌总发生率的80%-85%，如果没有
特别说明，肺癌指代非小细胞肺癌。
[来源：国家卫生健康委肿瘤和血液病相关病种诊疗指南（2022年版），《原发性肺癌诊疗指南（2022
年版）》，参考并修改]
3.3
福尔马林固定石蜡包埋Formalin-fixed paraffin embedded; FFPE
一种在组织学和病理学领域中常用的技术，用于制备组织样本以供显微镜下观察分析和组织保存。
这个过程通常分为三个主要步骤：固定（用标准中性福尔马林溶液处理样本使其稳定）、脱水（将固定
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2
后的组织浸泡在一系列浓度梯度不断增加的脱水试剂溶液中，最后用无水溶液处理，从而去除组织中的
水分）、包埋（将脱水后的组织样本放入熔化的石蜡中制成蜡块，以便可以制作切片用于后续处理）。
[来源：GB/T 42216.3-2022/ISO 20166-3:2018，《分子体外诊断检验福尔马林固定及石蜡包埋
组织检验前过程的规范》，参考并修改]
3.4
引物Primer
引物是指在DNA复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点的具有一定长度和顺序的
寡核苷酸链。
[来源：T/GDPMAA 0012—2023 高通量基因测序项目分类，参考并修改]
3.5
扩增子测序Amplicon sequencing
使用多对引物进行的PCR反应对目标序列进行扩增，并对产生的核酸产物进行高通量测序。
[来源：T/GDPMAA 0012—2023 高通量基因测序项目分类， T/GDPMAA 0011-2022 医疗机构分子病
理实验室建设规范，参考并修改]
3.6
探针捕获Probe capture
探针捕获是指通过设计合成有效的特异性探针，与待测样本中的基因组DNA进行杂交，从而将含有
靶序列的DNA片段进行分离和富集，并用于高通量测序。
[来源：GB/T 30989—2014，定义3.5，《高通量基因测序技术规程》，参考并修改]
3.7
文库Library
通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等获得的一个重建分子群，如基因组文库、互补DNA文库、
噬菌体展示肽文库等。
[来源：GB/T 30989—2014，定义3.5，《高通量基因测序技术规程》]
3.8
测序覆盖率Coverage rate of sequencing
参考序列目标区域中被样本测序序列覆盖的比例（测序覆盖率=目标区域内测序序列覆盖长度÷参
考序列目标区域非N碱基总长度）。
[来源：GB/T 30989—2014，定义3.30，《高通量基因测序技术规程》，参考并修改]
3.9
测序深度Depth of sequencing
待测样本中某个指定的核苷酸被检测的次数。
[来源：GB/T 30989—2014，定义3.31，《高通量基因测序技术规程》]
3.10
碱基识别质量Quality of base calling
评价碱基准确识别的概率。简称为Q，通常以数值表示，定义为Q=-10log10P。碱基识别质量值与碱
基识别错误率负相关，二者遵循对数函数关系。碱基识别质量值越高，错误率越低。如Q30指测序数据
中，碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%，或错误率为0.1%。
[来源：GB/T 30989—2014，定义3.29，《高通量基因测序技术规程》]
3.11
参考序列Reference sequence
测序片段对应的物种基因组序列。
[来源：GB_T 35890-2018，定义3.11，《高通量测序数据序列格式规范》]
3.12
变异Variation
样本中和参考序列不一致的核苷酸碱基序列，包括单核苷酸变异、插入型变异、缺失型变异、插入
缺失型变异、拷贝数变异、融合基因变异等。
[来源：T/SZGIA 4-2018，定义3.6，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]
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3
3.13
单核苷酸变异Single nucleotide variation
简称SNV，在基因组DNA上某一位置的单个核苷酸碱基发生改变。
[来源：T/SZGIA 4-2018，定义3.7，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]
3.14
插入/缺失变异Insertion-deletion variation
插入变异指在基因组DNA的某个位置上发生的小片段序列的插入，插入片段的长度在50 bp以下。缺
失变异指在基因组DNA的某个位置上发生的小片段序列的缺失，缺失片段的长度在50 bp以下。插入缺失
型变异简称Indel，在基因组DNA的某个位置上发生缺失的同时又有新的核苷酸碱基插入，发生改变的片
段长度在50 bp以下。
[来源：T/SZGIA 4-2018，定义3.8，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]
3.15
拷贝数变异Copy number variation
简称CNV，一般指长度为1 kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，通常由基因组内的部分
区域发生结构重排而导致。
[来源：T/SZGIA 4-2018，定义3.11，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]
3.16
基因融合Gene fusion
由于染色体水平上发生结构变化，导致两个不同基因的部分序列或全部序列发生连接，形成一个新
的基因。新的融合基因可能具有不同的结构和功能，可以导致异常细胞信号传导和增殖，从而促进肿瘤
的发展。
[来源：T/GDPMAA 0012—2023，《高通量基因测序项目分类》；T/SZGIA 4-2018，定义3.8，《临
床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CNV：拷贝数变异（Copy number variation）
DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）
FFPE：福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed paraffin embedded）
Indel：插入或缺失型变异（Insertion-deletion variation）
NGS：高通量测序/二代测序（High-throughput sequencing/Next-generation sequencing）
NSCLC：非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）
Post-PCR：PCR及PCR后处理
Pre-PCR：PCR前处理
RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）
RNase：核糖核酸酶（Ribonuclease）
SNV：单核苷酸变异（Single nucleotide variation）
UTR：非编码区（Untranslated region）
5 实验室分区、仪器设备及试剂
5.1 实验室分区
5.1.1 分区原则
对于开展NGS检测的实验室，因其灵敏度高的特点，实验室应采取适当预防措施，避免交叉污染，
最大限度降低污染导致假阳性结果的风险。应根据Pre-PCR和Post-PCR阶段的不同工作内容划分独立区
域，并有明显标志。针对NGS检测实验室中使用RNA作为起始样本，RNA提取与RNA建库前准备需要严格分
区，并保证无RNase污染，防止RNA的降解。
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5.1.2 实验室分区
实验室应当设置以下区域：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备Ⅰ区（扩增
子建库扩增完成后开盖前的操作；杂交捕获法全基因组文库制备）、文库制备Ⅱ区（扩增子建库扩增完
成后开盖后的连接或者二次扩增；杂交捕获法杂交和二次扩增）、测序和分析区。各区域在物理空间上
必须是完全相互独立的，无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全分隔状态，不能有空气直接
相通。根据使用仪器的功能，区域可根据实际情况适当合并。
5.1.3 分区要求
实验室的空气流向或者通风应作为实验室防污染的强制要求，工作流程和空气流向按照单一方向进
行，应按照试剂储存和准备区→样本制备区→文库制备区→测序和分析区进行，防止扩增产物顺空气气
流进入扩增前区域，可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。各区所属仪器和耗材应
专用，所用的器材（如移液器和吸头）不可混用。
5.2 仪器设备及试剂
5.2.1 仪器设备
宜包含以下仪器设备：
a) 组织脱水机；
b) 医学显微镜；
c) 生物安全柜（Ⅱ级或Ⅱ级以上）；
d) 二代测序仪；
e) PCR 仪；
f) 核酸超声波打断仪；
g) 冷冻离心机（最大离心力12000g 以上）；
h) 微量移液器；
i) 酶标仪；
j) 定量荧光计（可配合荧光染料检测试剂快速完成核酸浓度的读取，最低应能检测0.2 ng/μL
的核酸样本）；
k) 核酸片段分析仪；
l) 涡旋器；
m) 振荡器；
n) 核酸纯化仪；
o) 破碎仪（匀浆仪、均质器）；
p) 孵育器；
q) 核酸蛋白定量仪；
r) 冰箱（4℃、-20℃低温和-80℃超低温）；
s) 高性能生物信息学分析服务器。
5.2.2 试剂
宜包含以下试剂：
a) 核酸提取试剂；
b) PCR 扩增引物；
c) 捕获探针；
d) PCR 产物纯化试剂；
e) 文库制备试剂：试剂盒内至少应包含连接头、连接酶、聚合酶、缓冲液；
f) 二代测序试剂：试剂盒内至少应包含测序引物、高效测序反应酶、缓冲液；
g) 测序芯片。
6 检测内容和范围
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6.1 检测的基因和变异类型
6.1.1 检测范围内基因和变异的确定依据
参考国内外肺癌相关指南和专家共识，应至少检测与NSCLC发生和发展密切相关，并且与靶向治疗
密切相关的基因和特定基因变异，同时宜根据最新研究进展，包含具有潜在临床意义和靶向治疗方法的
基因和特定基因变异。
6.1.2 NSCLC 相关基因和基因组区域
宜纳入检测的NSCLC相关基因及基因组区域：
a) 检测范围应包括NSCLC 相关核心基因：EGFR、ALK、ROS1、RET、BRAF、KRAS、ERBB2、MET、NTRK1/2/3；
b) 检测内容应至少覆盖NSCLC 诊疗中具有明确临床意义的变异位点：EGFR L858R、EGFR Ex19 del、
EGFR T790M、EGFR Ex20 ins、EGFR S768I/L861Q/G719X/C797S、KRAS G12C、BRAF V600E、ERBB2
Ex20 ins 、ERBB2 Amplification 、MET Ex14 Skipping 、MET Amplification 、
ALK/ROS1/RET/NTRK1/NTRK2/NTRK3 fusion、ALK G1202R/L1196M、ROS1 G2032R/L2086F、NTRK1
G595R、NTRK3 F617L/G623R/G696A；
c) 检测范围可以包括具有潜在临床意义的扩展基因及其变异位点，同时扩展核心基因罕见位点检
测。如KRAS 基因第2、3 号外显子热点突变，NSCLC 癌症通路相关基因，免疫治疗相关基因，
靶向药物耐药相关基因等；
d) 如果需评估肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden，TMB）用于指导免疫治疗，则靶向测序
Panel 覆盖范围原则上不应少于300 个基因，覆盖基因组序列区域不宜<1.0 Mb，并建议与外
显子组测序（WES）评估的TMB 进行一致性评价；
e) 基因组区域应包括但不限于基因的编码区、UTR 区以及内含子区发生的已知热点突变或热点融
合断点区域等。
6.1.3 NSCLC 相关变异类型
检测变异类型应包括SNV、Indel、CNV以及重排/融合基因。
特定基因变异：与非小细胞肺癌密切相关的特定的基因变异，包括但不局限于DNA检测基础上的SNV、
Indel、CNV变异或染色体易位、中间缺失或染色体倒置等原因形成的融合基因等。
6.2 检测方法设计
6.2.1 基本要求
鉴于DNA和RNA样本特性及可检测变异类型的差异，二者需区别对待。鉴于NGS技术流程复杂，检测
实验室需根据自身能力选择以下合适的技术路线：
a) 基于DNA 水平的NGS（DNA-based NGS）可用于检测NSCLC 相关基因的各种变异类型，包括SNV、
Indel、CNV、染色体易位等，通过多重PCR 方法或探针捕获方法对相应基因组DNA 片段进行富
集。设计前，检测实验室需充分了解多重PCR 法和探针捕获法的优势和局限性，明确该检测产
品所采用的技术及所覆盖的变异类型；
b) 基于RNA 水平的NGS（RNA-based NGS）可用于检测NSCLC 相关融合基因变异、可变剪切、编
码区SNV、Indel 以及基因表达水平等。RNAseq 分为靶向RNA 测序和全转录组测序；靶向RNA
测序可选择多重PCR 方法或探针捕获方法，对临床样本中表达后的基因进行检测；
c) 检测实验室需要对靶向RNA 测序和全转录测序的优缺点进行充分了解，选择适合该实验室的技
术路线并对该方法做严格验证；如选择靶向RNA 测序的方法，则需充分了解多重PCR 方法和探
针捕获方法在基因融合检测中的优势和局限性，并明确该检测产品所覆盖的变异类型。
6.2.2 多重PCR 方法的引物设计
引物设计需依据以下原则：
a) 每个特定变异应设计至少1 对扩增引物，特定基因变异的扩增序列特异性要高，引物长度一般
为18 至24 个碱基，各引物之间不能互补，应避免非特异性扩增或引物二聚体；
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b) 多重PCR 的反应体系也会影响扩增效果，体系中的各组分需满足每对引物对应靶点的扩增量要
求；
c) 为了保证扩增产物产量尽可能一致，应尽可能选择有利于较长片段扩增的反应条件；
d) 每个特定变异的扩增子需要通过标准品或阴性/阳性样本进行验证；
e) 扩增子检测的特定基因变异包括但不局限于EGFR T790M 等变异。
6.2.3 探针捕获方法的探针设计
探针设计需依据以下原则：
a) 每个基因/变异区域应设计一定数目的捕获探针进行覆盖，捕获探针通过与基因组DNA 进行杂
交，将目标区域进行捕获并富集，然后通过主流二代测序平台进行高通量测序；
b) 捕获探针数量取决于所捕获的基因/变异区域大小以及探针覆盖策略（Tiling Strategy，具体
含义就是目标区域中每个碱基位点被多少条不同的探针覆盖），探针重叠区域为每个探针之间
的重叠碱基数目，重叠区域越大，目标区域覆盖率越高，但测序成本则越高；重叠区域越小，
甚至探针间隔分布，目标区域覆盖率越低，测序成本则越低；
c) 受捕获特异性等各种因素的影响，捕获探针设计应综合考虑探针类型、重叠测率、长度以及捕
获区域序列特性等因素，并进行实验条件摸索来获得最佳参数组合。需要注意的是，由于基因
组中存在高GC、重复序列等复杂结构，有些区域可能因探针设计困难而较难捕获。
7 样本采集、保存及运输
7.1 基本要求
样本类型为来源于非小细胞肺癌患者肺部或转移部位肿瘤组织的FFPE样本。样本采集应遵循以下原
则：采集肺部肿瘤组织并尽可能减少非肿瘤组织干扰；样本进行FFPE处理过程中，应避免样本间交叉污
染；及时处理和送检。
采样注意事项以及FFPE样本准备、保存与运输条件详见附录A。
7.2 样本验收标准
具体验收标准如下：
a) 样本来源：主要包括手术、支气管镜和胸腔镜下活检、CT 引导下肺穿刺、淋巴结穿刺活检等
方法获取的样本。活检或手术样本需要及时固定，一般要求离体样本需在60 分钟内固定，如
不能及时固定的样本需置于4℃环境中，以避免核酸降解影响检测结果；
b) 样本温度：应室温或冷藏运输；
c) 样本外观：FFPE 蜡块或切片，白片或蜡卷数量应根据切片厚度和组织大小适当增减。切片需
使用独立刀片，在干净容器及水池中独立捞片与贴片；
d) 样本大小：肿瘤组织应满足规定的大小，用于分子检测的穿刺样本应≥1 条，长度≥0.5cm；
e) 肿瘤含量：肿瘤细胞占比应满足检测要求即≥20%。若肿瘤细胞含量较低，可通过富集以保证
检测结果的准确可靠；
f) 样本信息：要求样本有对应的填写完整的检测申请单、送检须知等。申请单应涵盖但不限于
以下信息：受检者姓名、年龄、性别、送检医院、样本类型、检测项目、样本采集时间、样
本送检时间、临床初步诊断、病理诊断等（申请单与送检须知示例详见附录B）。
8 检测实验步骤
8.1 基本要求
实验所用试剂和方法可分为两种情况：
a) 使用商品化试剂盒：当使用专用于样本处理、核酸提取、文库构建和高通量测序的商品化试剂
盒时，应遵循制造商的使用说明；
b) 使用实验室自建程序：当实验室使用不同于商品化试剂盒的自建程序时，则应确认它符合检测
目的，并编写说明且遵守。使用不同制造商的商品化试剂盒可能影响结果，且不同产品可能不
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兼容。只有在各组件经过配套测试并经过确认符合检测目的和要求时，才可将其应用于正式检
测流程。
8.2 样本前处理以及核酸提取
8.2.1 样本前处理
样本在提取核酸前，首先检查验收样本合格，并且确认肿瘤细胞含量满足检测质控要求（建议≥20%）。
8.2.2 FFPE 样本核酸提取
选择适用于FFPE样本的核酸提取试剂盒，手动或使用全自动核酸提取仪对样本进行核酸提取。
8.2.3 核酸浓度测定
使用核酸蛋白定量仪测定并且记录核酸浓度。
8.2.4 核酸质量评估和保存
核酸质量评估：提取后应对核酸质量进行评估，评估指标可选择评估完整性、浓度、纯度等，具体
评估哪些指标应根据所使用建库试剂和方法对核酸的要求而设定，以利于后续的检测实验为基本原则进
行选择。常用指标包括OD230/260/280的吸光度、核酸片段长度、RNA完整值（RIN）以及DV200等。
核酸保存：由于DNA和RNA的化学结构和稳定性存在差异，其保存条件应独立设置。DNA应保存在含
有Tris-HCl成分的缓冲液中，可在4℃的环境中短期保存（1个月内），在-20℃的环境中长期保存（数
个月到数年）。RNA应保存在在无核酸酶水中，使用无核酸酶的耗材进行盛装，可在-20℃的环境中短期
保存（1个月内），在-80℃的环境中长期保存（数个月到数年），如有必要还可添加RNA稳定剂以降低
RNA的降解程度，进一步延长RNA的保存期。
8.3 文库构建
8.3.1 文库构建的方法
文库构建主流的方法包括扩增子建库法和液相杂交捕获法。
a) 扩增子建库法：
1) 以DNA 样本为建库模板时，使用特异性引物直接对基因组DNA 中目标区域进行多重PCR
扩增，并通过PCR 或连接的方式将与二代测序平台相匹配的接头和区分样本的测序标签
添加至目标序列，以制备成文库；
2) 以RNA 样本为建库模板时，先将RNA 进行逆转录得到cDNA（使用随机引物或特异性引物
取决于具体的应用目的），然后使用特异性引物直接对cDNA 中目标区域进行多重PCR 扩
增，再通过PCR 或连接的方式将与二代测序平台相匹配的接头和区分样本的测序标签添
加至目标序列，以制备成文库；由于使用特异性引物进行扩增时特异性较高，对RNA 样
本进行核糖体RNA 和/或珠蛋白mRNA 的去除步骤并不是必须的，具体是否需要主要根据
整体检测方法对灵敏度、特异性等的要求和目标而确定。
b) 液相杂交捕获法：
1) 以DNA 样本为建库模板时，将基因组DNA 片段化后进行片段末端修复、补平和加上末端
碱基，与二代测序平台相匹配的接头和区分样本的测序标签连接，并针对目标区域进行
液相杂交捕获和扩增，以制备成文库；
2) 以RNA 样本为建库模板时，需先将RNA 制备成片段化的双链cDNA 序列，该过程中包括逆
转录、片段化、一链/二链生成等多个过程，这些过程的具体顺序和操作流程取决于检测
方法所采用的建库试剂；接下来添加末端碱基，连接与二代测序平台相匹配的接头和区
分样本的测序标签，并针对目标区域进行液相杂交捕获和扩增，以制备成文库；对于组
织样本来源的RNA，全转录组测序通常需要对核糖体RNA 进行去除，而靶向RNA 测序则不
是必须的，具体操作需要根据整体检测方法对灵敏度、特异性等的要求和目标而确定。
8.3.2 文库质量控制
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文库构建后需对其进行质量控制，质控合格后才可以进行测序，质控指标应至少包括文库浓度（摩
尔浓度或质量浓度）、文库片段大小和其它指标。对文库进行质量控制时具体使用的仪器或者方法取决
于所采用的建库试剂对文库的要求。
8.4 高通量测序
进行测序时应注意：
a) 选择合格的文库、高通量测序试剂以及高通量测序平台，根据测序仪厂商提供的标准测序流
程进行测序操作；
b) 测序完成后，应对文库质量和测序数据进行统计和评估，确保样本的DNA 浓度、DNA 片段大小、
DNA 文库定量、测序数据量和质量（如Q30 值）符合性能确认阶段所确定的标准。
9 数据处理和分析
9.1 生物信息学分析流程
在对测序数据进行具体的生物信息分析之前，需先对下机数据进行数据完整性校验。然后将完整测
序得到的序列数据通过预处理、序列比对、变异检测、变异注释和质量控制分析等一系列过程，生成包
括原始测序序列FASTQ文件、待分析序列SAM/BAM文件、原始变异结果VCF文件、以及变异注释和质量报
告在内的生信分析结果。分析流程应明确所用人类参考基因组版本，并在整个分析流程中使用基因组版
本一致的数据库或数据文件。分析流程所包含工具和参数应当与性能确认流程保持一致，分析方法及参
数的变更需重新进行性能确认并进行文档记录。
9.2 测序数据质量控制
应根据性能确认阶段所确认的检测性能参数对生信分析的质量报告结果进行质量控制（QC），确保
质量合格后方可进行后续医学分析和报告。对于测序仪下机数据，应使用测序仪厂商提供的具体测序平
台的质量控制指标；对于检测样本数据，应使用表1中建议的质量控制指标。
表1 检测样本数据建议质量控制指标
质控类别质控指标参考阈值说明
原始测序数据
总数据量(Gb) 结合实验室panel设计及性能
测试样本的数据范围进行阈
值设定
测序产生的样本原始数据量
碱基质量值Q30 (%) 不低于75% 碱基的测序质量值(Phred
score，Qphred)超过30的比例
原始序列总数结合实验室panel设计及性能
测试样本的数据范围进行阈
值设定
测序产生的原始序列总数
GC含量百分比(%) 结合实验室panel设计及性能
测试样本的数据范围进行阈
值设定
碱基G和C的数量总和在总的
碱基数量中的占比
有效序列总数以及比例（%） 肿瘤样本不低于80%；配对样
本不低于90%
去除引物序列、接头序列及低
质量碱基后用于生物信息分
析的净序列总数及其在原始
序列总数中的占比
比对率/回贴率(%) 不低于98% 能够比对到参考基因组上的
序列数目及其在净序列总数
中的占比
原始测序数据
捕获效率(%) 按序列比例计算方法不低于
80%；按碱基比例计算方法不
低于60%
比对到探针捕获区域的序列
占比
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9
表1 检测样本数据建议质量控制指标（续）
质控类别质控指标参考阈值说明
重复率(%)a 肿瘤样本应低于35%；配对样
本应低于20%；并根据送检样
本类型进行相应调整
具有相同的起始和结束位置
且碱基排列完全相同的序列，
即重复序列所占的比例
待分析序列数据b
平均测序深度(X) 通常在肿瘤含量不低于20%
时，测序深度应不低于500X，
并根据变异类型、临床用途等
进行相应调整
目标区域的平均测序深度
≥**X的测序覆盖率(%) 应根据性能确认中所确定的
最低检测限（LOD）设定该指
标中的覆盖乘数，例如最低检
测限为变异频率不小于5%的
变异时，建议计算至“目标区
域中测序深度不低于100X的
区域所占的比例”。推荐使用
多重指标，例如分别计算目标
区域中覆盖深度不低于50X、
100X、200X等区域所占的比
例。
目标区域中测序深度不低于
**X的区域所占的比例
插入片段大小结合实验室panel设计及性能
测试样本的数据范围进行阈
值设定
通过检测双端序列在参考基
因组上的起止位置,可以得到
测序片段的实际大小,即插入
片段大小(insert size)
均一性结合均一性计算方法、实验室
panel设计，及性能测试样本
的数据范围进行阈值设定
测序得到的数据在目标区域
分布的均一程度，即均一性
（uniformity）
与配对样本或对照组相比的
覆盖度概况（测试优度）c
结合实验室panel设计及性能
测试样本的数据范围进行阈
值设定
基于配对样本或基线对照样
本采用配合度检验类方法评
估样本的覆盖度分布
a 适用于基于探针捕获方法的测序数据和基于扩增子测序方法且添加分子标签技术的测序数据。
b 去除低质量、重复序列后用于生信数据分析的序列数据。
c 有染色体拷贝数检测需求的场景应使用该指标。
10 性能确认
10.1 方案选择
临床实验室可参考CNAS-CL02《医学实验室质量和能力认可准则》选择性能验证方案或性能确认方
案。
10.2 性能验证
按照相关标准、制造商说明书或作业指导书规定的方法对实验方法进行性能验证。
10.3 性能确认时机
性能确认应在以下情况下进行：
a) 仪器在投入使用前应通过性能确认。仪器搬迁、仪器故障维修后、仪器更新升级，应重新进
行确认；
b) 核酸提取试剂、PCR 产物纯化试剂、文库构建试剂、二代测序试剂等试剂在使用前应通过性能
确认。更换试剂品牌前，应重新进行确认；
c) 核酸提取、文库制备等方案流程的确定前应通过性能确认。更换方案前，应重新进行确认；
d) 数据库建立和生信分析流程应用前应通过性能确认。数据库更新以及在原有检测基因和变异
类型基础上增加新的基因和变异类型并扩大检测范围后，应重新进行性能确认。
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10
10.4 测序平台的性能确认
依据检测项目及临床预期用途，综合考虑测序读长和通量、测序准确率、运行时间、测序成本等选
择测序平台。安装时，由厂方工程师按照说明书所注明的仪器性能指标逐项验证，达到广方声称的指标
并满足临床预期用途为合格。
10.5 生物信息分析平台的性能确认
实验室可以选择商业化的自动分析系统，或者根据检测项目和预期用途选择合适的算法和软件，搭
建本实验室的生物信息学分析流程，并进行必要的性能确认（最低测序数据量、准确度、灵敏度、特异
性、精密度、最低检测限等），以保证对相关基因和突变类型的检测准确性。应使用阳性临床样本进行
全流程检测，并结合计算机数据模拟变异的方式，进行生物信息分析平台的性能确认。
10.6 分析性能确认
10.6.1 准确度/灵敏度/特异性
对于定性分析，准确度、灵敏度和特异性是指与比对试验或者标准方法检测结果的相关性。可以选
择以下两种不同类型的样本来进行分析性能确认：
a) 使用标准参考品。使用已知突变信息（基因、变异、变异比例）的商业化标准参考品进行分
析性能确认，评价定性检测的准确度、灵敏度和特异性；
b) 使用真实临床样本。选择阳性临床样本，该临床样本应已经过参比方法的验证，参比方法可
以为金标准方法、行业公认方法、经验证性能符合要求并满足临床预期用途的方法等。选取
样本的数量需要具有统计学意义，建议至少59 例样本。比较检测结果与参比方法之间的差异，
不一致的结果再用其它方法进一步验证，通过阳性符合率和阴性符合率评价定性检测的准确
度、灵敏度和特异性。
10.6.2 精密度
精密度包括同一批样本用同一种方法和同一种仪器的重复性精密度，以及不同时间、不同操作人员、
不同仪器（相同型号）、不同实验批次之间的再现性精密度：
a) 对同一批样本在同一条件下（相同的环境、操作人员及仪器）应至少进行3 次以上检测，评价
重复性精密度；
b) 对不同时间、不同操作人员、不同仪器（相同型号）应至少进行3 次以上检测，评价再现性精
密度；
c) 重复性精密度和再现性精密度评价各自的重复检测次数至少3 次，可在实验流程中安排同时进
行；
d) 建议使用变异比例为3 倍LOD 左右（即2~4 倍LOD 之间）的阳性样本进行精密度实验，不同
变异类型应至少使用1 例样本进行精密度验证实验，评价精密度的指标包括阴阳性符合率、
变异系数（CV）等。
10.6.3 最低检测限
在分子检测领域，最低检测限是指用该项分子测试技术能够测到生物样本中待测靶核酸分子的最低
含量。实验室应建立不同样本类型、不同变异类型的最低检测限。通常选择混合参考品（定值标准物质）
并进行梯度稀释和检测，计算出最低检测限值。
生信分析方法应以标准参考品和真实临床样本为主要验证对象，对分析流程的准确度、灵敏度、特
异性、精密度、最低检测限等进行充分验证。当真实临床样本数量不足时，需要通过模拟数据验证分析
流程的理论极限值。
11 质量控制
11.1 室间质量评价
检测机构应参加相应的实验室室间质评项目，当无实验室室间质评项目可利用时，可通过与其他实
验室比对（即室间比对）的方式确定检验结果的可接受性。实验室应规定比对实验室的选择原则（如已
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11
获认可的实验室、使用相同检测方法的实验室）、样品数量（应包括正常和异常水平）、频率、判定标
准等。实验室负责人或指定人员应监控室间比对活动及其结果，并在结果报告上签字。
11.2 室内质量评价
11.2.1 基本要求
每次实验应设置阴性质控物和阳性质控物。
11.2.2 阴性质控物
用于识别外部污染、试剂污染或样本间交叉污染。
11.2.3 阳性质控物
为含有一种或多种检测范围内基因和变异类型的样本，用于监测检验过程是否正常和满足质控要求。
11.2.4 环境质控
实验室还应定期进行室内环境内和设备上的污染物的检测，对环境和设备进行采样，使用荧光定量
PCR或者该实验室正在开展的NGS检测方法均可。应至少每月进行1次检测。如发现环境内、设备上存在
污染物，应立即对实验室进行彻底清洁，包括但不限于地板、桌面、墙壁、天花板、设备表面、设备与
实验耗材或试剂接触的部位等。
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12
A
A
附录A
（规范性）
采样方式和注意事项以及FFPE 样本准备、保存与运输条件
A.1 采样方式和注意事项
A.1.1 肿瘤组织采集
临床采集样本时应剔除坏死、出血、黏液和钙化组织。样本获取过程可导致出血、气胸等一系列并
发症，且样本需经固定、石蜡包埋、H&E染色、免疫组化及显微镜镜检等步骤明确诊断，多个步骤会消
耗较多样本，为有足够样本进行后续基因检测，在尽量避免并发症的同时，应尽可能在精准前提下多获
取样本。
A.1.2 根据病变的位置和类型的不同，可采用以下几种采样方式。
A.1.2.1 经气道活检样本
经气道活检样本采样方式如下：
a) 支气管镜可视气道内病变。对于镜下所见新生物活检时，如无特殊情况，5 块活检样本可满足
病理免疫组织化学染色及基因检测需要。活检时应取材良恶交界处，避免活检坏死区域。建
议使用第2、3 块活检样本涂片，行快速现场评价，明确样本质量，必要时增加活检次数；
b) 支气管镜不可视气道内病变。与支气管相通肺外周病变患者行活检时，建议应用X 线透视、
电磁导航、虚拟导航、径向支气管内超声、超细支气管镜、快速现场评价等手段，以提高诊
断阳性率，增加取材量；
c) 气管、支气管腔外病变。对于气管、支气管腔外病变，推荐经支气管针吸活检（TBNA）、支
气管腔内超声引导经支气管针吸活检（EBUS-TBNA）、支气管腔内超声引导经支气管活检钳活
检（EBUS-TBFB）及支气管腔内超声引导经支气管冷冻活检（EBUS-TBMC），尤其推荐后两种
方法，获取样本量更大。样本获取后建议进行快速现场评价，以评估样本中肿瘤细胞数量及
质量；
d) 不与气道相通肺内病变。尤其肺外周病变，建议选择影像引导经皮肺活检，活检前可行PET-CT、
增强CT 等检查，明确病灶有活性部位，避免活检肿瘤坏死区域，影响检测结果。活检后建议
行快速现场评价，以评估样本中肿瘤细胞数量及质量。
A.1.2.2 经皮壁层胸膜活检样本
部分肺部恶性肿瘤患者需取材于胸膜转移灶，可选择超声引导经皮壁层胸膜活检、CT引导经皮壁层
胸膜活检及内科胸腔镜下壁层胸膜活检，其中胸腔镜下壁层胸膜活检推荐冷冻活检，取材样本量大。活
检后均建议行快速现场评价，以评估样本中肿瘤细胞数量及质量。
A.1.3 支气管镜下肺癌组织样本和细胞学样本常见的取材方式包括活检钳活检、支气管刷检和肺泡灌
洗，应分别按照以下要求和注意事项进行。
A.1.3.1 活检钳活检
操作前应核查患者各项检查结果，制订完整的手术计划。钳取标本前应吸除支气管内分泌物，窥清
病变部位。对支气管腔内可视病灶，活检时宜在肿瘤与正常黏膜交界处取标本，不要在坏死明显部位取
标本。对管壁浸润或增厚者，可在病变黏膜下注射少量生理盐水，使病变组织隆起，更利于取材。在病
情允许的情况下，至少行3～4次活检，以保证所得肺组织样本能够进行病理及分型诊断、分子学诊断等
用途。
A.1.3.2 支气管刷检
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支气管刷检推荐使用一次性细胞刷，以避免交叉污染和感染的发生。可在活检部位刷取，以提高阳
性率。对于在直视下仅见一些非特异性改变或未见异常者，应在相应的部分先行刷检，然后再行钳检，
以免钳检后出血，影响视野，或刷片有较多红细胞影响检出率。
A.1.3.3 肺泡灌洗
根据影像学(主要是CT)表现选择BAL（肺泡灌洗）的操作部位。BAL操作前6周内的高分辨率CT影像
是较为理想的参考依据。一般使用20ml或60ml的注射器灌注37℃左右(或室温)的0.9%无菌氯化钠溶液
(0.9%NaCl)，推荐灌注3～5次，总量一般为100～200ml。支气管镜应嵌紧支气管开口处，以免液体外漏。
每次灌注液体后，随即用注射器负压吸引回收，也可直接通过支气管镜吸引至无菌容器中。最佳吸力应
由操作者在可视情况下控制，一般以25～100mmHg(1mmHg＝0.133 kPa)的负压为宜。一般情况下，肺中
叶或舌叶的BALF回收率约为灌入量的40%～70%，肺下叶或其他肺叶至少为30%以上。用于BALF细胞分类
计数的回收液一般需达到10～20ml，最少为5ml。
A.1.4 快速现场评价（ROSE）
是指在检查等介入操作过程中由细胞病理学家现场对穿刺小标本进行制片和染色，并进行快速评价、
向操作者反馈穿刺是否成功、提供初步诊断的一种方法。当快速现场评价为非诊断材料或恶性细胞比例
低，或因临床需要获取更多靶标本行基因检测等情况时，则需要再次穿刺。
A.1.4.1 ROSE 操作流程
具体操作流程如下：
a) 钳夹标本，需以7 号注射器针头的针尖将组织标本抵于玻片，以同心圆式涂片；
b) 毛刷标本需以纵向滚移或同心圆式滚涂于玻片；
c) 灌洗液标本，需快速离心，弃上清，吸取适量标本滴于玻片，以另一玻片压平后再拉开。涂
片忌原地碾压复涂。涂片后立即空气干燥固定或者使用含乙醇的液体固定。涂片后剩余的组
织置入病理瓶中待送至病理科行常规病理检查；
d) 根据现场取材情况，每例患者至少活检2 块组织、涂片2 张以做ROSE 评估，在支气管镜操作
现场，采用迪夫染液（Diff-Quick stain）对ROSE 细胞学涂片进行快速染色。
A.1.4.2 ROSE 判读
巴氏细胞病理学会指南将细胞学评估结果分为5类：C1示没有诊断性价值的标本或标本不适当；C2
示良性病变；C3示标本诊断可疑，可能为良性；C4示标本诊断可疑，可能为恶性；C5示恶性病灶。如果
标本分类为C2、C5提示标本取样满意、适当，若分类为C3、C4则酌情重新取样以期得到肯定结论。如分
类为C1，则必须重新取样。
A.1.5 样本后续处理
A.1.5.1 活检钳活检
标本放在小片滤纸上，立即浸入盛有10%中性福尔马林溶液的小瓶内固定送检。
A.1.5.2 支气管刷检
刷检后毛刷进行涂片，送细胞学检查的涂片应置于95%酒精中固定送检。
A.1.5.3 肺泡灌洗
应尽量在1h内将BALF送检，新鲜的BALF可直接用于实验室检测；如果转运时间超过30min，应在4℃
条件下(置于冰上)转运；若转运时间超过1h，建议先将BALF进行低速离心(250～300g，10min)，保持细
胞完整性，然后将细胞沉渣重新悬浮于特定的细胞培养液中(MEM＋25mmol/L HEPES或RPMI1640＋
25mmol/L HEPES)，4℃保存，24 h内进行检测；若无离心条件，可将MEM或RPMI加入灌洗液中，4℃保存，
12h内检测。BALF不可冷冻或用干冰转运。
A.1.5.4 样本固定建议选择中性福尔马林固定液
推荐原因如下：
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a) 组织固定：中性福尔马林固定液用于固定组织样本，使其保持原始的形态和结构。它能够交
联细胞和组织中的蛋白质，防止其在后续处理过程中的降解和变性，从而保持组织的形态和
可观察性；
b) 杀菌作用：中性福尔马林固定液具有较强的杀菌作用，可以杀死细菌、真菌和病毒等微生物，
从而避免组织样本在处理过程中的污染和降解；
c) 保存作用：中性福尔马林固定液可以延缓组织样本的腐败和降解，使其能够在一定时间内得
到有效保存。这对于长期保存组织样本以及后续的组织学研究和病理学诊断非常重要；
d) 防止免疫原性损失：中性福尔马林固定液可以减少组织样本中免疫原的损失，保持其免疫学
特性，有利于后续的免疫组织化学和免疫组织染色等实验。
A.2 FFPE 样本准备、保存与运输
A.2.1 肿瘤组织脱钙
含骨或钙化组织的样本需用弱酸（如甲酸）或螯合剂（如EDTA）进行脱钙，避免强酸脱钙处理。
A.2.2 肿瘤组织固定
固定前的操作时间应当越短越好，最优为组织离体0.5小时之内完成，尽量不超过1小时；小块组织
宜固定6至12小时，大块组织需切开后固定12至48小时；为避免过度固定，总固定时间不应超过72小时。
固定液应选择中性福尔马林缓冲溶液（使用磷酸盐缓冲溶液PBS配制），体积至少应为待固定组织体积
的3至5倍。
A.2.3 肿瘤组织脱水
应按照标准作业程序定期更换脱水机内的脱水试剂。
A.2.4 FFPE样本制作
为防止交叉污染，要求使用一次性刀片；每切完一个蜡块后应认真清理设备，不得残留其它病例的
组织碎屑；切片数量应满足上机要求（≥10张）；检测前应进行H&E染色评估肿瘤细胞含量，肿瘤含量
应达到20%以上，最佳含量为30%以上，肿瘤细胞体积至少达到0.2mm3。
A.2.5 FFPE样本保存
蜡块尽可能无切面常温存储，避免氧气和其它环境因素如光、真菌、昆虫等侵扰，用于高通量测序
检测不超过2年为最优；白片可短时间室温或较长时间4℃保存。
A.2.6 FFPE样本运输
应室温或冷藏运输。
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15
B
B
附录B
（资料性）
申请单模板与送检须知示例
B.1 申请单模板示例
实体肿瘤分子检测知情同意书
1.本检测只适用于检测指定肿瘤基因的DNA水平/RNA水平的突变。
2.根据检测项目不同，可用于辅助临床进行遗传性肿瘤风险分层、诊断、治疗、预后评估或动态监测。
3.科学数据表明，部分患者不存在明确的基因突变，因此未检测到基因突变的检测结果是客观存在的。但该结果并不是
完全无用的信息，并不能证明所有的治疗方法有效或无效，它能够证明在本次样本中不存在检测范围内基因的突变，这
同样可以辅助医生制定治疗方案。
4.检测报告根据基因突变情况提示用药相关性，报告不能作为一个完整的诊断报告，不具备医嘱性质，仅供医生参考，
并由医生根据临床实际情况制定治疗方案。
5.由于不可抗拒因素（包括但不限于病人不良的身体状况、采血量不达标、采血管破裂、自然灾害等）所致的检测无法
顺利进行，受检者可能需要配合检测机构再次取样（如果因样本运输或其他非检测原因造成的延误不计算在检测周期
内）。
6.受检者的个人识别信息、健康信息及检测数据在检测过程中将按照中国相关法律法规及政策规范相关要求进行严格保
护及慎重使用。签署本知情同意书即表明您同意授权检测机构将您的样本及数据在匿名状态下用于后续独立或合作性的
研究及教育目的，以推动该领域医学进展。
7.本检测不承诺、不保证进入医疗保险或其他商业保险报销目录。
8.本次基因检测报告仅对此次送检样本负责。
我已经知晓本检测相关的《知情同意书》的所有内容，完全自愿慎重进行肿瘤分子检测，承担检测带来的相关风险，并
承诺提供的个人信息真实有效，包括但不限于身份信息、病历病理、诊断报告、检测报告和其他必要资料。
受检者或代理人签字______________ 代理人与受检者关系______________ 签字日期____________
患者基本就诊信息
患者
*姓名_________ *性别_____ *年龄______ *联系方式_________ *门诊/住院号_________
病房/床号_________ 身份证号_____________________________________________
医院*医院_________________ *科室__________ *医生__________ *电话_____________
疾病
*肿瘤类型__________ *临床分期______期*初次确诊时间_______年_______月
临床病理诊断
样本信息
样本时间*采样时间____年____月____日*送检时间____年____月____日
样本来源*□原发灶□复发灶□转移灶□外周血（ctDNA） □其他
样本类型
*组织：蜡块____个，白片____张病理号__________________
*外周血：____ml，EDTA抗凝____管，BCT无创____管
*胸腹水____ml（不少于100ml）：□细胞蜡块
B.2 送检须知示例
B.2.1 送检样本必须为10%的中性福尔马林固定的样本，建议于离体后30分钟内被固定（最长不超过1
个小时）。
B.2.2 样本不能出现坏死、钙化及大量结缔组织、脂肪组织等异常情况。
B.2.3 检测用肿瘤细胞含量应≥20%，建议肿瘤细胞含量≥30%。
B.2.4 病理医生评估肿瘤含量≥20%的样本，肿瘤细胞体积至少达到0.2mm3。可送检蜡块或或适当数量
的白片或蜡卷（置于1.5ml离心管中），同时送检H&E片1张或加送白片1张用于H&E染色后进行肿瘤含量
评估。
B.2.5 当肿瘤细胞＜20%时，不接受蜡卷样本，仅接受蜡块或白片样本，方便实验室对肿瘤细胞进行富
集，同时送检H&E片1张或加送白片1张用于H&E染色后进行肿瘤含量评估。
B.2.6 若为穿刺组织或肿瘤切面较小，需适当增加送检白片或蜡卷数量，保证组织样本抽提获得的DN
A量应达50ng以上。
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B.2.7 为保证成功率，请尽可能送检一年以内的FFPE样本，不接受H&E染色或免疫组化染色后切片。
B.2.8 所送检样本需附病理报告复印件。
B.2.9 随样本应附《检测申请单》，申请单上患者临床信息应完整，必须提供病理诊断结果，样本固
定液浓度及固定时间。
B.2.10 如有特殊要求，应在相应位置注明。
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17
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