NY/T 4499-2025 不结球白菜品种鉴定 SSR分子标记法

以下是《NY/T 4499-2025 不结球白菜品种鉴定SSR分子标记法》核心内容的系统总结：

​​一、标准基础信息​​

• ​​标准号​​：NY/T 4499-2025
• ​​名称​​：不结球白菜品种鉴定SSR分子标记法
• ​​发布日期​​：2025-01-09
• ​​实施日期​​：2025-05-01
• ​​归口单位​​：全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC 277）
• ​​起草单位​​：农业农村部科技发展中心、华南农业大学、上海市农业科学院、南京农业大学

​​二、适用范围​​

• 适用于不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种的DNA分子数据采集和品种鉴定。

​​三、技术原理​​

• 利用不结球白菜基因组中稳定遗传的​​简单重复序列（SSR）标记​​，通过PCR扩增及电泳检测不同品种在同一SSR位点的重复次数差异（等位变异），实现品种区分。

​​四、核心流程与要求​​

​​1. 样品准备​​

• ​​样品类型​​：种子、幼苗、叶片等组织（种子需符合GB/T 3543.2扦样要求）。
• ​​样本量​​：每份样品不少于30个个体，等量混合分析；必要时进行个体检测。

​​2. DNA提取​​

• ​​推荐方法​​：CTAB法（详细步骤见标准10.2）：
  • 研磨组织后加入CTAB提取液，65℃水浴45-60min。
  • 三氯甲烷-异戊醇（24:1）抽提，异丙醇沉淀DNA。
  • 乙醇洗涤后溶解于TE缓冲液或双蒸水，检测浓度（OD260/OD280宜为1.7-2.0）。

​​3. PCR扩增​​

• ​​反应体系​​（总体积20μL）：

  组分	终浓度	体积（μL）
  10×缓冲液（含Mg²⁺）	1×	2.0
  dNTPs	0.2 mmol/L	1.6
  Taq酶	0.05 U/μL	0.2
  引物（正向/反向）	0.25 μmol/L	各1.0
  DNA模板	2.5 ng/μL	2.0

• ​​反应程序​​：
  • 94℃预变性5min → 35循环（94℃ 30s → 55℃ 30s → 72℃ 45s）→ 72℃延伸10min → 4℃保存。

​​4. 电泳检测​​

• ​​两种方法可选​​：
  • ​​(1) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）​​：
    • 制胶：6% PAGE胶（含尿素），亲和硅烷/剥离硅烷处理玻璃板。
    • 样品变性：95℃ 5min后冰浴。
    • 电泳条件：1800V恒压，时间按片段大小调整（100-250bp对应1.5-3.5h）。
    • 银染显影：固定液→染色液（硝酸银）→显影液（NaOH+甲醛）→定影。
  • ​​(2) 荧光毛细管电泳​​：
    • 引物分组：按附录F将23对引物分为5组（根据荧光标记与片段范围）。
    • 多重检测：同组内不同荧光标记引物的PCR产物混合上样。
    • 变性：95℃ 5min后冰浴，使用DNA分析仪检测。

​​5. 数据分析​​

• ​​等位变异确定​​：
  • 通过参照品种（附录E）或分子量标准确定片段大小。
  • 记录格式：纯合位点（X/X）、杂合位点（X/Y，小片段在前）、缺失（0/0）。
• ​​结果比对​​：
  • 逐一比对送检样品与对照样品的每个SSR位点。
  • 统计检测位点数和差异位点数。

​​五、结果判定规则​​

• ​​判定标准​​：
  • 差异位点数 ​​> 2​​ → 判定为 ​​“不同”​​。
  • 差异位点数 ​​≤ 2​​ → 判定为 ​​“疑同”​​。
• ​​结果表述模板​​：

  “送检样品与对照样品采用[检测方法]，检测位点数为[数量]，差异位点数为[数量]，判定为[不同/疑同]。”

​​六、关键附录内容​​

1. ​​附录A​​：仪器与试剂清单
   • 仪器：PCR仪、电泳系统、离心机、核酸浓度测定仪等。
   • 试剂：CTAB、dNTPs、SSR引物、荧光染料（6-FAM/ROX/TAMRA/HEX）等。
2. ​​附录B​​：溶液配制方法
   • CTAB提取液、TE缓冲液、10×TBE、银染试剂等详细配方。
3. ​​附录C​​：23对SSR引物序列及染色体定位（核心标记）。
4. ​​附录D​​：引物详细信息
   • 荧光标记推荐、等位变异范围（如BrcSSR22: 155-191bp）、参照品种示例。
5. ​​附录E​​：84个参照品种清单（如甬青805、叶家青001），标注来源单位。
6. ​​附录F​​：荧光毛细管电泳引物分组方案（5组，避免片段重叠）。

​​七、注意事项​​

1. ​​引物使用​​：
   • PAGE检测用普通引物，毛细管电泳需荧光标记引物（标记于正向引物5'端）。
   • 可序贯检测，差异位点数达判定标准时即可停止。
2. ​​参照品种​​：
   • 用于校正等位变异大小，需与待测样品同步检测。
   • 同一名称不同来源的品种可能存在等位变异差异。
3. ​​数据可靠性​​：
   • 缺失位点需记录为0/0，避免漏检导致误判。
   • 毛细管电泳需用参照品种消除仪器系统误差。

​​总结​​：该标准系统规范了利用SSR分子标记鉴定不结球白菜品种的全流程，涵盖样品处理、DNA提取、PCR扩增、电泳检测、数据分析及结果判定，并提供了详尽的试剂、引物和参照品种支持数据，确保鉴定结果的准确性和可重复性。