NY/T 4629-2025 牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定 高效液相色谱法

以下是对《NY/T 4629-2025 牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法》标准的详细总结：

​​1. 标准核心信息​​

• ​​标准号​​：NY/T 4629-2025
• ​​名称​​：牛乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法
• ​​适用范围​​：
  • ​​产品类型​​：生牛乳、巴氏杀菌牛乳、添加含IgG成分的牛乳基婴幼儿配方乳粉。
  • ​​定量限​​：
    • 液态乳（生牛乳、巴氏杀菌乳）：10 mg/kg
    • 婴幼儿配方乳粉：40 mg/kg

​​2. 测定原理​​

• ​​提取​​：用磷酸盐缓冲溶液（pH 7.00±0.05）提取样品中的IgG。
• ​​净化富集​​：通过Protein G亲和柱（2 mg protein G/mL）选择性吸附IgG，去除杂质。
• ​​洗脱​​：用甘氨酸洗脱溶液（pH 2.50±0.05）释放IgG。
• ​​检测​​：高效液相色谱（HPLC）结合紫外检测器（280 nm）定量分析。
• ​​定量方法​​：外标法（标准曲线法）。

​​3. 关键试剂与材料​​

• ​​缓冲体系​​：
  • 磷酸盐缓冲溶液（pH 7.00±0.05）：用于样品提取和亲和柱活化。
  • 甘氨酸洗脱溶液（0.1 mol/L, pH 2.50±0.05）：用于洗脱IgG。
• ​​色谱流动相​​：
  • A相：0.1%三氟乙酸水溶液（色谱纯）
  • B相：0.1%三氟乙酸乙腈溶液（色谱纯）
• ​​标准品​​：
  • 免疫球蛋白IgG标准储备液（8.5 mg/mL），需按附录A校正浓度。
  • 标准系列溶液浓度：5–200 mg/L（临用现配）。
• ​​其他关键材料​​：
  • Protein G亲和柱（1 mL容量）
  • 0.45 μm玻璃纤维滤纸（样品初滤）
  • 0.22 μm水系微孔滤膜（HPLC进样前过滤）

​​4. 仪器设备​​

• ​​核心设备​​：
  • 高效液相色谱仪（配紫外/二极管阵列检测器）
  • 色谱柱：C₄反相柱（250 mm × 4.6 mm, 3.5 μm, 300 Å）
• ​​辅助设备​​：
  • 紫外分光光度计（标准品浓度校正）
  • 高速离心机（≥12,000 r/min）
  • 固相萃取装置（亲和柱操作）
  • pH计（精度±0.01）

​​5. 样品前处理步骤​​

​​（1）提取​​

• ​​液态乳​​：称取10 g样品 → 加30 mL磷酸盐缓冲液 → 涡旋 → 定容至50 mL → 12,000 r/min离心10 min → 0.45 μm玻璃纤维滤纸过滤。
• ​​婴幼儿配方乳粉​​：称取5 g样品 → 后续步骤同液态乳。

​​（2）净化（亲和柱操作）​​

1. 活化：10 mL磷酸盐缓冲液过柱。
2. 上样：20 mL滤液过柱。
3. 淋洗：10 mL磷酸盐缓冲液去除杂质。
4. 洗脱：4 mL甘氨酸洗脱溶液收集IgG。
5. 定容：洗脱液用甘氨酸溶液定容至5 mL → 0.22 μm滤膜过滤 → 待测。

​​6. HPLC分析条件​​

• ​​色谱条件​​：
  • 流速：1.5 mL/min
  • 柱温：65℃
  • 进样量：30 μL
  • 检测波长：280 nm
• ​​梯度洗脱程序​​：

  时间 (min)	A相 (%)	B相 (%)
  0	95	5
  6.5	62	38
  10.0	62	38
  12.0	40	60
  15.0	40	60
  15.5	95	5
  20.0	95	5

​​7. 定性与定量分析​​

• ​​定性​​：
  • 以标准品保留时间为基准，样品中IgG峰保留时间偏差需≤±2.5%。
• ​​定量​​：
  • 标准曲线：5–200 mg/L浓度范围，线性相关系数（R）≥0.99。
  • 样品浓度需在标准曲线范围内，超出时需稀释后重新测定。

​​8. 结果计算​​

• ​​公式​​：

  /omega = /frac{/rho /times V_3 /times V_1 /times 1000}{m /times V_2 /times 1000} /times f

  • /rho：标准曲线查得浓度（mg/L）
  • V_3：上机液定容体积（5 mL）
  • V_1：样品处理液总体积（50 mL）
  • m：样品质量（g）
  • V_2：过柱滤液体积（20 mL）
  • f：稀释倍数（若需稀释）
• ​​结果表示​​：平行测定两次，取算术平均值，保留3位有效数字。

​​9. 方法精密度​​

• ​​允许偏差​​：平行测定结果的绝对差值≤算术平均值的10%。

​​10. 附录关键内容​​

• ​​附录A（规范性）​​：
  • IgG标准储备液浓度校正方法：
    • 紫外分光光度法测定280 nm和320 nm吸光度。
    • 计算公式：

      X = /frac{(A_{280} - 1.7 /times A_{320})}{1.4} /times /frac{V_1}{V_2}

      （A_{280}/A_{320}为吸光度；V_1为移取体积；V_2为定容体积；1.4为IgG比色光系数）
• ​​附录B（资料性）​​：
  • IgG标准溶液（40 mg/L）色谱图（保留时间约7.5 min），见图B.1。

​​11. 责任单位与起草信息​​

• ​​提出单位​​：农业农村部畜牧兽医局
• ​​归口单位​​：全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC 274）
• ​​主要起草单位​​：
  中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室等8家机构。
• ​​主要起草人​​：刘慧敏、郑楠、王象欣等10人。

​​总结要点​​

该方法通过​​磷酸盐缓冲液提取​​、​​Protein G亲和柱特异性富集​​、​​甘氨酸溶液洗脱​​，结合​​HPLC梯度洗脱分离​​，实现对牛乳及乳制品中IgG的高灵敏度、高选择性定量分析。标准详细规定了前处理步骤、色谱条件、结果计算及质量控制要求，适用于液态乳和配方乳粉中IgG的合规性检测。