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NY/T 544-2025 猪流行性腹泻诊断技术
- 名 称：NY/T 544-2025 猪流行性腹泻诊断技术 - 下载地址2
- 类 别：农牧渔类
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资料介绍
中华人民共和国农业行业标准 NY/T 544-2025《猪流行性腹泻诊断技术》总结
一、标准概况
- 标准名称：猪流行性腹泻诊断技术（Diagnostic techniques for porcine epidemic diarrhea）
- 替代版本：NY/T 544-2015
- 主要修订内容：
- 新增样品采集与处理流程（第7章）。
- 新增间接免疫荧光法（IDIFA，第10章）和实时荧光RT-PCR（第13章）。
- 修改间接ELISA方法（第15章）。
- 新增综合判定标准（第16章）。
二、适用范围
- 适用于猪流行性腹泻（PED）的诊断、监测，涵盖临床诊断与实验室检测方法。
三、临床诊断（第5章）
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流行病学：
- 传播季节：全年可发，寒冷季节高发。
- 易感群体：各日龄猪均易感，7日龄内哺乳仔猪死亡率达100%。
- 传染源：病猪、带毒猪、隐性感染猪。
- 传播途径：粪-口、乳汁、胎盘、空气传播。
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临床症状：
- 哺乳仔猪：呕吐、水样腹泻（黄色/灰色）、脱水、扎堆、高死亡率。
- 断奶猪/育肥猪：厌食、短暂腹泻后恢复。
- 成年猪：厌食、一过性腹泻，偶见流产。
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病理变化：
- 肉眼病变：小肠膨胀、肠壁变薄、肠内容物含黄色液体。
- 组织学：小肠绒毛萎缩（绒毛高度/隐窝深度比从7:1降至3:1）。
- 超微结构：肠细胞空泡化、微绒毛终末网消失。
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结果判定：
- 符合流行病学且出现临床症状或病理变化，判为疑似病例，需实验室确诊。
四、实验室诊断方法
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样品采集与处理（第7章）：
- 粪便：采集后与PBS混合，离心取上清。
- 小肠及内容物：匀浆后制成悬液，离心取上清。
- 保存：-20℃备用。
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病毒分离与鉴定（第8章）：
- 细胞培养：使用Vero细胞，观察CPE（细胞粗糙、多核、空斑）。
- 盲传：未出现CPE时盲传2-3代。
- 判定：出现CPE需结合其他方法（如荧光法、RT-PCR）确认。
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直接免疫荧光法（DIFA，第9章）：
- 原理：荧光标记抗体检测病毒抗原。
- 样本处理：小肠冰冻切片或细胞载玻片固定。
- 结果：胞浆绿色荧光为阳性。
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间接免疫荧光法（IDIFA，第10章）：
- 原理：一抗（血清）结合病毒，二抗（FITC标记）显色。
- 结果：胞浆绿色荧光、核蓝色（DAPI染色）为阳性。
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夹心ELISA（第11章）：
- 步骤：包被抗体→加样本→加酶标抗体→显色。
- 判定：P/N≥2且OD≥0.2为阳性。
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RT-PCR（第12章）：
- 靶基因：扩增PEDV的774bp片段。
- 电泳判定：出现目标条带为阳性。
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实时荧光RT-PCR（第13章）：
- 靶基因：ORF3基因（108bp）。
- 判定：Ct≤30为阳性，30<Ct≤35需复检。
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血清中和试验（第14章）：
- 原理：测定血清中和病毒能力。
- 效价判定：≥1:8为阳性，1:4为疑似。
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间接ELISA（第15章）：
- 抗原：重组N蛋白。
- 判定：S/P≥0.35为阳性。
五、综合判定（第16章）
- 确诊PED：临床疑似且任一实验室方法阳性。
- 潜伏感染：无症状但RT-PCR/实时荧光RT-PCR阳性。
- 既往感染：无症状但血清学阳性（中和试验/间接ELISA）。
六、支持性附录
- 病理学图示：小肠绒毛萎缩（附录A）。
- 溶液配制：PBS、培养液等（附录B）。
- 检测方法图示：细胞病变、荧光检测、电泳结果等（附录C-I）。
- 重组蛋白制备：N蛋白表达与纯化（附录J）。
七、生物安全
- 所有操作需符合GB 19489实验室安全要求，包括样品处理、病毒分离及核酸检测。
八、修订意义
- 新增技术：提升检测灵敏度（如实时荧光RT-PCR）、简化流程（如间接免疫荧光法）。
- 完善判定：明确综合诊断标准，区分潜伏感染与既往感染。
- 标准化：统一样品处理与试剂配制，确保结果可比性。
该标准为PED的诊断提供了全面、多角度的技术方案，兼顾传统方法与现代分子技术，适用于不同场景下的精准检测与防控。