T/GAIA 029-2025 尿液中多环芳烃代谢物的测定 液相色谱-串联质谱法

《尿液中多环芳烃代谢物的测定 液相色谱-串联质谱法》团体标准主要内容的详细总结：

​1. 标准概述​

• ​标题：​​ 尿液中多环芳烃代谢物的测定 液相色谱-串联质谱法 (Determination of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolites in the urine samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry)
• ​标准号：​​ T/GAIA 0292025
• ​发布与实施：​​ 2025年4月17日发布，2025年4月24日实施。
• ​归口单位：​​ 广东省分析测试协会。
• ​起草单位：​​ 广州市疾病预防控制中心、广州市越秀区疾病预防控制中心、广州市番禺区疾病预防控制中心、沃特世科技(上海)有限公司、上海爱博才思分析仪器贸易有限公司。

​2. 范围 (Scope)​​

• 规定了尿液中 ​9种羟基多环芳烃 (OH-PAHs) 代谢物的测定方法。
• 目标化合物：1-羟基萘、2-羟基萘、2-羟基芴、3-羟基芴、1-羟基菲、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、1-羟基芘。
• 适用性：适用于尿液中上述单个或多个OH-PAHs的检测。
• 应用目的：用于尿液中OH-PAHs内暴露水平监测（评估人体接触多环芳烃的程度）。

​3. 规范性引用文件 (Normative References)​​

• 主要引用了GB/T 6682《分析实验用水规格和实验方法》。

​4. 原理 (Principle)​​

• ​酶解 (Enzymatic Hydrolysis)：​​ 尿液中的多环芳烃代谢物（主要是葡萄糖醛酸苷和硫酸酯结合物）经β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶在37℃、pH 5.0条件下水解16小时，释放出游离的羟基多环芳烃。
• ​萃取 (Extraction)：​​ 酶解后的尿液样品加入内标后，用正己烷进行液液萃取​（重复3次），合并有机相。
• ​浓缩与复溶 (Concentration & Reconstitution)：​​ 萃取液经氮吹浓缩至干，残渣用乙腈-水溶液 (2+8, V/V) 复溶。
• ​检测与定量 (Detection & Quantification)：​​ 复溶液采用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)​​ 进行分析，使用内标法定量。

​5. 试剂与材料 (Reagents and Materials)​​

• ​主要试剂：​​ 超纯水、正己烷、乙腈、甲醇、异丙醇、乙酸、乙酸钠、β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶(>100,000 units/mL)。
• ​试剂配制：​​ 明确给出了乙腈-水溶液 (2+8, V/V)、氢氧化钠溶液 (100g/L)、乙酸-乙酸钠缓冲液 (pH=5.0)、异丙醇-甲醇溶液 (1+9, V/V) 的配制方法。
• ​标准品：​​ 列出了9种目标OH-PAHs和6种对应的氘代内标（1-羟基萘-D8, 2-羟基萘-D8, 3-羟基芴-D9, 1-羟基菲-D9, 2-羟基菲-D9, 1-羟基芘-D9）的要求（纯度≥99.0%，-18℃避光保存）。附录A提供了详细的中英文名称、分子式、CAS号。
• ​标准溶液制备：​​ 详细描述了各级标准溶液的配制方法、浓度、溶剂和保存条件：
  • 单标储备液 (100 μg/mL，乙腈，-18℃，6个月)
  • 混合标准中间液 (1.00 μg/mL，乙腈，-18℃，3个月)
  • 混合标准使用液 (100 μg/L，乙腈，-18℃，1个月)
  • 内标储备液 (100 μg/mL，乙腈，-18℃，6个月)
  • 混合内标中间液 (1.00 μg/mL，乙腈，-18℃，3个月)
  • 混合内标使用液 (100 μg/L，乙腈，-18℃，1个月) - 用于标准曲线
  • 混合内标使用液 (10.0 μg/L，乙腈，-18℃，1个月) - 用于样品前处理加标

​6. 仪器和设备 (Apparatus and Equipment)​​

• 主要仪器：LC-MS/MS仪、分析天平（感量0.1mg和0.01g）、离心机（≥5000 r/min）、涡旋振荡器（≥3000 r/min）、移液器（10-100μL, 100-1000μL）、氮吹浓缩仪、恒温振荡器。

​7. 试样的制备与保存 (Sample Preparation and Storage)​​

• ​样品要求：​​ 新鲜或解冻后混合均匀的尿液。强调生物安全处理要求。
• ​取样量：​​ 推荐1.0 mL - 2.0 mL，最小不宜低于1.0 mL。
• ​保存条件：​​ -70℃以下保存，避免反复冻融。

​8. 分析步骤 (Analytical Procedure)​​

• ​酶解：​​ 取1.00 mL尿液，加1 mL pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液，加20 μL酶，混匀，37℃水浴酶解16小时。
• ​加内标：​​ 酶解后样品中加入40 μL混合内标使用液 (10.0 μg/L)，涡旋混匀。
• ​萃取：​​ 加入3 mL正己烷，充分振荡（2000 r/min 10 min + 3000 r/min 10 min），离心（5000 r/min, 10 min），取上清液至氮吹管。重复萃取两次（每次3 mL正己烷），合并所有上清液。
• ​浓缩与复溶：​​ 合并的萃取液在室温下氮吹至干。用200 μL乙腈-水溶液 (2+8, V/V) 溶解残渣，供LC-MS/MS分析。

​9. 测定 (Determination)​​

• ​仪器条件：​​
  • ​LC条件：​​
    • 色谱柱：C18柱 (100 mm × 4.6 mm, 2.7 μm 或相当者)
    • 柱温：35℃
    • 进样量：5 μL
    • 流速：0.3 mL/min
    • 流动相：A相 - 水；B相 - 异丙醇-甲醇溶液 (1+9, V/V)
    • 梯度洗脱程序：详见标准文本表1（0-38 min，B相从35%升至100%再降回35%）。
  • ​MS/MS条件：​​
    • 离子源：电喷雾离子源 (ESI)
    • 扫描方式：负离子模式 (Negative Ion)
    • 检测方式：多反应监测 (MRM)
    • 关键参数：毛细管电压(2.5kV)、去溶剂化温度(500℃)、雾化气/气帘气/辅助气(氮气)、碰撞气(氩气)。
    • ​化合物特定参数：​​ 标准文本表2详细列出了9种目标物和6种内标物的定性离子对 (Qualifier ion pair)​、定量离子对 (Quantifier ion pair)​、锥孔电压 (Cone Voltage, V)​​ 和碰撞能量 (Collision Energy, eV)​。这是定性和定量的核心依据。附录B提供了特征离子色谱图示例。
• ​标准曲线制作：​​ 用混合标准使用液(100 μg/L)和混合内标使用液(100 μg/L)配制系列标准工作液(浓度点：0.100, 0.200, 0.500, 1.00, 2.00, 5.00, 10.0 μg/L)，内标浓度为2.00 μg/L。以待测物浓度(μg/L)为横坐标，待测物峰面积与相应内标峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线。
• ​定性与定量：​​
  • ​定性：​​ 样品中目标物保留时间与标准品偏差≤±2.5%，且定性离子对与定量离子对的相对丰度比与标准品一致（允许偏差符合标准文本表3的规定）。
  • ​定量：​​ 采用内标法，根据标准曲线计算待测液中目标物的浓度。浓度超出线性范围需稀释或减少取样量后重新处理。
• ​空白试验：​​ 除不加尿样外，其余步骤与试样处理相同。

​10. 结果计算与表述 (Calculation and Expression of Results)​​

• 计算公式：
  Xi = (Ci × V) / Vi
  • Xi：尿样中羟基多环芳烃i的含量 (μg/L)
  • Ci：由标准曲线计算得到的待测液中羟基多环芳烃i的浓度 (μg/L)
  • V：试样溶液最终定容体积 (μL) (本方法为200 μL)
  • Vi：试样溶液取样体积 (μL) (本方法为1000 μL)
• ​结果表示：​​ 计算结果需扣除空白值，以两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

​11. 方法的灵敏度、准确度和精密度 (Method Performance Characteristics)​​

• ​灵敏度 (取样量1 mL时)：​​
  • 方法检出限 (MDL)：所有9种目标物均为 ​0.02 μg/L。
  • 方法定量限 (LOQ)：所有9种目标物均为 ​0.05 μg/L。
• ​准确度 (回收率)：​​ 在添加浓度0.1 μg/L - 10.0 μg/L范围内，回收率为 ​60% - 120%​。
• ​精密度：​​ 在重复性条件下，两次独立测定结果的绝对差值不得超过其算术平均值的 ​20%​。

​附录 (Appendices)​​

• ​附录A (资料性)：​​ 化合物中英文名称、化学分子式和CAS号。包含9种目标物和6种内标的详细信息。
• ​附录B (资料性)：​​ 羟基多环芳烃标准溶液 (1.0 μg/L) 的特征离子质量色谱图示例。

​总结:​​
该标准详细规定了一种使用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 测定人尿液中9种关键多环芳烃(PAH)暴露生物标志物——羟基多环芳烃(OH-PAHs)的分析方法。方法核心步骤包括酶解释放结合态代谢物、正己烷液液萃取、氮吹浓缩、LC-MS/MS分析（负离子MRM模式）和内标法定量。标准明确了方法适用范围、原理、所需试剂与仪器、样品前处理详细流程、仪器最佳操作条件、定性与定量依据、结果计算方式以及方法的关键性能指标（检出限0.02 μg/L，定量限0.05 μg/L，回收率60-120%，精密度RSD≤20%）。附录提供了化合物信息和典型色谱图，具有完整的规范性和可操作性。该方法灵敏、准确、专属性强，适用于人群PAH内暴露水平的生物监测。