T/CVMA 231-2025 猪萨佩罗病毒病诊断技术规范

​​《猪萨佩罗病毒病诊断技术规范》（T/CVMA 231-2025）主要内容总结​​

​​1. 范围​​

本文件规定了猪萨佩罗病毒病（Porcine Sapelovirus Disease, PSV）的临床诊断、实验室检测方法（病毒分离与鉴定、RT-PCR、实时荧光RT-PCR、ELISA）的技术要求，适用于该病的诊断、检疫、监测及流行病学调查。

​​2. 规范性引用文件​​

• 主要引用NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》。

​​3. 术语和定义​​

无特殊术语需界定。

​​4. 缩略语​​

列出常用缩略语（如PCR、ELISA、RNA等）及其全称。

​​5. 临床诊断​​

• ​​流行病学​​：
  • 宿主：家猪和野猪，经粪-口传播，春冬季高发，易与其他肠道病毒混合感染。
• ​​临床症状​​：
  • 腹泻、肺炎、共济失调、肢体瘫痪（脊髓灰质炎综合征）；母猪繁殖障碍（流产、死胎等）。
• ​​病理变化​​：
  • ​​剖检​​：小肠绒毛萎缩、脑充血、肺泡扩张破裂。
  • ​​组织学​​：神经细胞空泡化、肺间质充血。
• ​​结果判定​​：符合临床症状或病理变化可初步判定为疑似病例，需进一步实验室确诊。

​​6. 样品采集与处理​​

• ​​采样工具​​：解剖器械、离心管、防护用具等。
• ​​试剂​​：PBS、青霉素/链霉素溶液。
• ​​样品类型​​：组织（小肠、肺、脑）、粪便、血液。
• ​​处理方法​​：研磨、离心、过滤（0.22μm）。
• ​​保存与运输​​：4℃保存≤24小时，长期保存需-80℃避免反复冻融。

​​7. 病毒分离与鉴定​​

• ​​方法​​：
  • 使用猪睾丸细胞（ST细胞）接种样品滤液，观察致细胞病变效应（CPE）。
  • 若出现CPE（细胞圆缩、脱落），收集病毒液；无CPE需盲传2~3代。
• ​​结果判定​​：CPE阳性且RT-PCR或荧光RT-PCR验证为阳性，则判定病毒分离阳性。

​​8. RT-PCR检测​​

• ​​步骤​​：
  1. ​​RNA提取​​：TRIZOL法或试剂盒法。
  2. ​​反转录​​：生成cDNA。
  3. ​​PCR扩增​​：使用特异性引物（PSV F1/R1，扩增210 bp片段）。
  4. ​​电泳检测​​：1%琼脂糖凝胶，210 bp条带为阳性。
• ​​结果判定​​：阳性对照有条带、阴性对照无条带时，样品出现210 bp条带判为阳性。

​​9. 实时荧光RT-PCR检测​​

• ​​步骤​​：
  • 使用特异性引物（PSV F2/R2）和探针（FAM标记）。
  • 反应程序：40个循环（95℃ 5s→60℃ 30s）。
• ​​结果判定​​：
  • ​​阳性​​：Ct≤35且扩增曲线典型。
  • ​​阴性​​：Ct≥38或无扩增曲线。
  • ​​可疑​​：35<Ct<38需复检。

​​10. 间接ELISA检测抗体​​

• ​​步骤​​：
  1. ​​抗原包被​​：PSV-VP1蛋白（1μg/mL）。
  2. ​​封闭​​：BSA封闭非特异性结合。
  3. ​​加样​​：血清样本80倍稀释。
  4. ​​酶标抗体​​：HRP标记抗猪IgG（1:6000）。
  5. ​​显色与终止​​：TMB显色，450 nm测OD值。
• ​​结果判定​​：
  • ​​阳性​​：OD≥0.3（阳性对照OD>1.0，阴性对照OD≤0.2）。

​​11. 综合判定​​

• 临床疑似病例需通过实验室任一方法（病毒分离、RT-PCR、荧光RT-PCR或ELISA）阳性确诊。

​​附录A（试剂配制）​​

详细列出PBS、细胞培养液、封闭液等配方（如TAE缓冲液、DEPC水等）。

​​附录B（阳性对照制备）​​

• 构建含PSV 5'UTR基因片段的重组质粒（pMD-PSV），用于RT-PCR和荧光PCR阳性对照。

​​附录C（引物与反应条件）​​

• RT-PCR引物（PSV F1/R1）和荧光PCR引物/探针（PSV F2/R2及FAM探针）序列及反应程序。

​​附录D（ELISA抗原制备）​​

• 通过原核表达系统制备PSV-VP1重组蛋白，纯化后作为ELISA包被抗原。

​​文件特点​​

1. ​​全面性​​：涵盖临床诊断、病原检测（分离、分子生物学）和抗体检测（ELISA）。
2. ​​标准化​​：严格规定试剂配制、操作步骤及结果判读标准。
3. ​​实用性​​：提供详细的附录（如引物序列、阳性对照制备方法），便于实验室操作。
4. ​​科学性​​：结合CPE观察、分子检测和血清学方法，确保结果准确性。

该标准为猪萨佩罗病毒病的诊断和防控提供了技术依据，适用于兽医实验室、检疫机构及养殖场。