T/SXSL 16-2024 猪耳缘成纤维细胞培养技术规范

IICS 65.020.30
CCS B43
团体标准
T/SXSL 16-2024
猪耳缘成纤维细胞培养技术规范
Technical specifications for porcine ear margin fibroblast culture
2024-12-29 发布2025-01-29 实施
陕西省饲料协会发布
T/SXSL 16-2024
Ⅰ
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由陕西省饲料协会提出并归口。
本文件起草单位：西北农林科技大学、陕西正能农牧科技有限责任公司、杨凌衍数生物科技有限公
司、陕西省畜牧产业试验示范中心、陕西省畜牧技术推广总站、大荔县畜牧发展中心。
本文件主要起草人：胡建宏、温飞、冯贤辀、高磊、张毅、陈辉、连星、李胜、陈晓旭、郭松茂、
田佳卉、韩帅琪、胡张涛、贾永宏、于太永、张曼、杨晓茹、席华明、赵彩会、罗强。
本文件为首次发布。
本文件由西北农林科技大学负责解释。
单位：西北农林科技大学。
地址：陕西省咸阳市杨凌区邰城路3 号。
电话：15600913628
邮编：712100
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猪耳缘成纤维细胞培养技术规范
1 范围
本文件描述了猪耳缘成纤维细胞培养技术规范的术语与定义、溶液配制、供体选择、组织块获取、
原代培养、传代培养、细胞冻存、质量检测。
本文件适用于酶消化法分离培养猪耳缘成纤维细胞。
2.规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
DB65/T 3502-2013 绵羊耳缘皮肤组织成纤维细胞体外培养技术规程
NY/T 3075-2017 畜牧养殖场消毒技术
3 术语与定义
3.1 供体（Donor）
提供耳缘组织的猪。
3.2 耳缘成纤维细胞（Ear margin fibroblast）
来自于耳缘的成纤维细胞。成纤维细胞是一种形态多样的细胞类型，呈梭型或不规则三角形，具
有卵圆形的核和突起的胞质。
3.3 细胞培养（Cell culture）
在适当的条件下（37 ℃，5% CO2）培养，让细胞生长和增殖。
3.4 细胞传代（Cell passage）
将培养的细胞在一定的条件下进行分离、再培养的过程。
4 试剂耗材及仪器设备
试剂耗材及仪器设备参照附录A执行；
溶液配制参照附录B执行。
5 供体选择
符合品种特征，三代谱系清晰，健康的6月～12月龄种猪。
6 组织块获取
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按照DB65/T 3502-2013执行。
7 原代培养
7.1 将耳组织块用75%酒精清洗3次后，转移至PBS（含有5%双抗）中清洗3次，随后将其转入超净工
作台。
7.2 用手术刀片刮去组织块表皮及皮下组织，保留真皮层，PBS冲洗2次后，将组织用无菌剪刀剪成1
mm3小块。
7.3 用巴氏吸管将组织块转移至50 mL离心管，使其自然沉淀，移去上清液，加入2 mL PBS（含有2%
双抗），冲洗3次后，弃上清。
7.4 加入25 mL 2%的Ⅰ型胶原酶，37 ℃水浴摇床中消化60 min。
7.5 1500 rpm离心5 min后，弃去离心管中的胶原酶，并用PBS冲洗组织块3次。随后加入组织块:胰蛋
白酶=1:3～5的0.25%胰蛋白酶（含EDTA），置于37 ℃ 5% CO2培养箱消化。
7.6 消化完毕后，加入完全培养基（10% FBS）终止消化，反复吹打后，40 μm细胞筛过滤。
7.7 将所得细胞悬液1200 rpm 离心5 min，弃上清，加入完全培养基（10% FBS）重悬沉淀并接种于
细胞皿中，37 ℃ 5% CO2 培养箱培养，待48 h 后观察细胞贴壁状态并更换培养基。
8 传代培养
8.1 细胞汇合度达到80%时，弃去原有的细胞培养液，加入PBS 洗涤3 次。
8.2 弃去PBS，加入0.25%的胰蛋白酶（含EDTA），轻轻摇动使之均匀分散布满整个皿底。
8.3 放入37 ℃ 5% CO2 培养箱中3 min 后，在显微镜下观察细胞形态。
8.4 当60%细胞变圆并开始脱落时，立即加入FBS 终止消化。
8.5 加入完全培养基，用移液枪轻轻吹打，使细胞团分散成单个细胞。
8.6 当细胞全部脱落后，1200 rpm 离心5 min，获得细胞沉淀，加入完全培养基重悬细胞并计数，按
3×105 个细胞/6 孔板的密度传代培养。
8.7 细胞汇合度达到80%继续传代或冻存。
9 细胞冻存
9.1 当细胞汇合度至80%并处于对数生长期时，弃去细胞上清液，加入PBS洗涤2次。
9.2 加入0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化3 min。
9.3 当60%的细胞开始变圆并开始脱落时，立即加入含10% FBS培养基终止消化。
9.4 用移液枪吹打皿底5～10次，收集培养液，1200 rpm离心5 min。
9.5 弃上清，加入4 ℃预冷的细胞冻存液，调整细胞密度至5×105个/mL。
9.6 按每管1 mL细胞悬液的体积分装于无菌细胞冻存管中，严密封口。
9.7 标明畜种、性别，细胞名称、代数，冻存编号、日期等信息。
9.8 放入细胞冻存盒中，-80 ℃冰箱冷冻保存，16 h后移入液氮保存。
10 质量检测
10.1 耳缘成纤维细胞的鉴定
10.1.1 取耳缘成纤维细胞接种至24 孔细胞培养板中，每孔1×104 个细胞。
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10.1.2 当细胞汇合度达到70%时，弃去培养基，PBS 洗涤2 次。
10.1.3 4%多聚甲醛室温固定10 min。
10.1.4 用PBS 洗涤3 次，加入0.3% Triton X-100 室温渗透破膜10 min。
10.1.5 用PBS 洗涤3 次，加入封闭液（PBS+5% BSA）室温孵育1 h。
10.1.6 加入稀释后的一抗（Vimentin 波形蛋白抗体，抗体稀释倍数参照说明书），置于4 ℃孵育16 h。
10.1.7 从4 ℃冰箱中取出复温1 h；弃一抗，PBS 洗涤3 次。
10.1.8 加入稀释后的二抗（FITC 绿/Cy3 红，抗体稀释倍数参照说明书），室温避光孵育2 h。
10.1.9 弃二抗，用PBS 洗涤3 次，加入稀释后的DAPI（1:1000）复染细胞核。在荧光倒置显微镜
下观察并计数，计算阳性细胞数比例（荧光细胞的数量/蓝色（DAPI）细胞的数量）。
10.2 耳缘成纤维细胞数量测定
将盖玻片盖在血球计数板上，吸取细胞悬液滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间，
静置3 min 后镜下观察。计算计数板上5 个中方格的细胞总数（4 角和正中）。
计算公式：细胞数/mL＝5 个中方格中的细胞数×5（即计数室25 个中方格的总细胞数）×10（1 mm3
内的细胞数）×1000（每毫升中细胞数）。
注意：每样品观察上下两个计数室，取平均值，如两个计数室计数结果误差超过5%，则应重检。
10.3 耳缘成纤维细胞活率测定
10.3.1 取10 μL 细胞悬浮液与10 μL 0.4% Trypan Blue 混合均匀于1.5 mL 离心管中。
10.3.2 吸取10 μL 悬液置于血球计数板上，盖上盖玻片。
10.3.3 显微镜下随机取3 个视野，分别记录死细胞和活细胞数，合并计算细胞活率。
10.3.4 每样品观察2 次，取平均值，如2 次计数结果误差超过5%，则应重检。
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附录A
（资料性附录）
试剂耗材及仪器设备表
表A 试剂耗材及仪器设备表
试剂耗材使用说明
青链霉素细胞培养用
0.25%胰蛋白酶溶液细胞培养用
DMEM/F12培养基细胞培养用
DMSO 细胞培养用
剃毛器、耳缺钳耳缘组织采集
PBS 细胞培养用
15 mL和50 mL无菌无酶离心管细胞提取
巴氏吸管细胞提取
血球计数板细胞计数
1.5 mL细胞冻存管细胞保存
40 μm细胞滤网细胞提取
15 mL 离心管细胞提取
0.22 μm滤器细胞培养
细胞培养皿细胞培养
倒置显微镜细胞鉴定
高压灭菌锅器械灭菌
冰箱试剂存放
细胞培养箱细胞培养
离心机细胞提取
恒温水浴锅细胞提取
超净工作台无菌操作
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附录B
（规范性附录）
溶液配制
B.1 10% FBS细胞培养液：88 mL DMEM/F12＋10 mL FBS＋2 mL双抗（1%）。
B.2 2% I型胶原酶：0.1 g I型胶原酶溶于50 mL DMEM/F12中，0.22 μm滤器过滤后使用。
B.3 冻存液配制：按照DMEM/F12:FBS:DMSO = 7:2:1体积比配制。
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