T/CVMA 216-2025 写刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法
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- 标准类型：团体标准规范
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-06-21
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资料介绍
T/CVMA 216-2025《小反刍兽疫病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法》主要内容总结
1. 标准概述
- 标准性质：团体标准（中国兽医协会归口），编号T/CVMA 216-2025。
- 适用范围：检测羊血清中的小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体，适用于动物疫病监测和防控。
- 技术原理：基于双抗原夹心ELISA法，通过包被抗原捕获血清中的PPRV抗体，再结合酶标抗原形成复合物，显色后通过OD值判定抗体水平。
2. 核心内容
（1）试剂与材料
- 关键试剂：
- 重组蛋白：小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白（包被用）和pET-32a-(NH)蛋白（酶标用）。
- 酶结合物：HRP标记的pET-32a-(NH)蛋白。
- 对照品：阴性对照（健康羊血清）、阳性对照（免疫羊高滴度血清）。
- 其他试剂：封闭液（含BSA和蔗糖）、洗涤液（PBS-Tween）、显色液（TMB）、终止液（硫酸溶液）等，配制方法详见附录D。
（2）仪器设备
- 酶标仪（450 nm）、恒温培养箱（37℃）、微量移液器（0.5–1000 μL）、96孔酶标板等。
（3）样品处理
- 采集：按NY/T 541规范采集羊血液，离心分离血清（无溶血、无污染）。
- 保存：短期（2–8℃）、长期（-20℃以下）。
（4）检测步骤
- 样品稀释：血清10倍稀释后加入包被板（90 μL稀释液 + 10 μL样品）。
- 孵育：37℃ 30分钟，洗涤3次。
- 加酶结合物：100 μL/孔，37℃ 30分钟，洗涤3次。
- 显色：加入TMB显色液（A+B），37℃ 15分钟。
- 终止与读值：加终止液后，酶标仪读取450 nm OD值。
（5）结果判定
- 试验有效性：阳性对照（PC）与阴性对照（NC）OD差值≥0.4。
- 判定标准：
- 阴性：S/P值（样品OD/PC均值）< 0.2。
- 阳性：S/P值≥ 0.2。
3. 附录关键信息
- 附录A：重组蛋白制备
- 通过大肠杆菌表达系统（pET-30a/pET-32a载体）生产N和NH蛋白，经超声破碎、镍柱纯化、透析后保存。
- 附录B：包被板制备
- 包被抗原浓度1 μg/mL（碳酸盐缓冲液），封闭后37℃干燥保存。
- 附录C：对照血清制备
- 阴性对照：未感染羊血清；阳性对照：疫苗免疫羊高滴度血清（效价≥1:512）。
- 附录D：试剂配制
- 详细列出缓冲液（如包被液pH 9.6）、封闭液（含BSA和ProClin-300防腐剂）、显色液（TMB-甲醇溶液）等配方。
4. 其他说明
- 专利声明：标准可能涉及专利，但发布机构不承担识别责任。
- 起草单位：中国动物疫病预防控制中心牵头，联合多个省级疫控中心和企业。
- 应用意义：为PPRV抗体检测提供标准化方法，支持疫病净化和流行病学调查。
总结：该标准详细规范了PPRV抗体ELISA检测的全流程，涵盖试剂制备、操作步骤、结果判读及质量控制，确保检测的准确性和可重复性。