T/CVMA 177-2024 猫疱疹病毒感染诊断技术规范
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资料介绍
ICS 11.220
CCS B 41
团体标准
T/CVMA 177—2024
猫疱疹病毒感染诊断技术规范
Technical Specification for diagnosis of feline herpesvirus infection
2024 - 9 - 9发布2024 - 9 - 9实施
中国兽医协会 发布
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、上海基灵生物科技有限公司、东莞博盛生物科技有限公司、北京市动物疫病预防控制中心、北京动物园管理处、山东省动物疫病预防与控制中心、山东合润检测技术有限公司、上海市动物疫病预防控制中心、广州源博医药科技有限公司、天津农垦康嘉生态养殖有限公司。
本文件主要起草人：梁瑞英、梁琳、汤新明、丁家波、侯绍华、朱旭、王弋、刘昕、张启龙、贾婷、金红岩、刘存、刘砚涵、孙振、赵洪进、赖强。
T/CVMA 177—2024
1
猫疱疹病毒感染诊断技术规范
1 范围
本文件规定了猫疱疹病毒感染的流行病学和临床症状的诊断依据，以及猫疱疹病毒PCR、荧光PCR实验室检测的技术要求和操作规范。
本文件适用于猫疱疹病毒感染的诊断。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
T/CVMA 42 猫疱疹病毒荧光定量PCR检测方法
T/CVMA 113 猫疱疹病毒1型微滴式数字PCR检测方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
FHV：猫疱疹病毒（Feline herpesvirus，FHV）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
SDS：十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate）
TAE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_乙酸_乙二胺四乙酸（Tris Acetate-EDTA buffer）
TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_硼酸_乙二胺四乙酸（Tris-Borate-EDTA buffer）
5 诊断原则
猫疱疹病毒感染的诊断以病原学检测为主，结合流行病学史、临床症状进行综合分析，做出诊断。流行病学史和临床症状是FHV感染的重要诊断依据，病例确诊需严格的病原学检测依据。
T/CVMA 177—2024
2
6 诊断依据
6.1 流行病学
6.1.1 患猫发病前不久接触过FHV病猫或者无症状感染猫或患病猫使用过的用具。
6.1.2 患猫发病前有过生活环境的改变，比如寄养、更换住处、运输、进入多猫环境或去过医院。
6.1.3 收容所、猫舍等群养猫中出现了群发性呼吸道疾病，尤其在新引进猫后，未注射疫苗的猫症状更严重。
6.1.4 流浪猫或户外活动的猫发生呼吸道疾病。
6.2 临床症状
6.2.1 患病猫出现精神不佳、食欲下降，具有发热症状的猫可出现精神沉郁、嗜睡和食欲不振等症状，部分猫精神或食欲无异常。
6.2.2 打喷嚏、眼鼻分泌物增多、结膜炎、流涎等症状至少出现一种。
6.2.3 少数病例出现咳嗽、口腔溃疡和肺炎中的一种或者一种以上的症状。
6.3 结果判断
患病猫出现6.1和6.2的任一项，可初步判定为猫疱疹病毒感染的临床疑似病例，需要进一步做实验室诊断。
7 样品采集、保存、运输及处理
7.1 样品采集
将无菌棉拭子用灭菌生理盐水充分浸润，采集眼、鼻和口拭子样本。眼部应采集结膜囊内黏膜分泌物；深入鼻腔内部贴壁采集鼻腔黏膜分泌物；口腔应尽量采集咽喉深处黏膜分泌物。将采集后拭子放入已装好病毒保存液的商品化样本收集管内（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液），折断手柄，随即密封即完成取样，编号并填写相应采样单，样品尽快送检，送检时添加冰袋保持低温。
7.2 样品保存及运输
用于病毒核酸检测的样品应尽快送检，可在24 h之内检测的样本可置于4 ℃保存，24 h内无法检测的样本于-70 ℃或以下保存，如无-70 ℃保存条件，可置于-20 ℃冰箱暂存。
7.3 样品处理
取7.1收集的眼、鼻、口拭子保存液，4 ℃，2000 g离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。
8 猫疱疹病毒的PCR检测
8.1 仪器
8.1.1 PCR扩增仪。
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3
8.1.2 高速台式冷冻离心机。
8.1.3 生物安全柜。
8.1.4 移液器。
8.1.5 电泳仪。
8.1.6 电泳槽。
8.1.7 紫外凝胶成像仪。
8.2 耗材
8.2.1 离心管（1.5 L、200 μL）。
8.2.2 移液器吸头（2.5 μL、10 μL、100 μL）。
8.3 试剂
8.3.1 试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T 6682中一级水的要求。
8.3.2 无水乙醇。
8.3.3 10%SDS：配方见附录A.1。
8.3.4 蛋白酶K贮备液：配方见附录A.2。
8.3.5 TAE电泳缓冲液：配方见附录A.3。
8.3.6 TBE电泳缓冲液：配方见附录A.4。
8.3.7 病毒核酸提取试剂盒。
8.4 引物
猫疱疹病毒PCR扩增引物序列见附录B.1。
8.5 猫疱疹病毒DNA提取
8.5.1 取200 μL 7.3处理的样品，加入25 μL 10% SDS和10 μL 的20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育2 h。
8.5.2 放置到室温，加入等量的饱和酚溶液500 μL，振荡混匀20 s，10000 g 离心5 min，取上清液。
8.5.3 加入等量的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，振荡混匀20 s，10000 g，离心5 min，取上清液。
8.5.4 再加入等量的氯仿：异戊醇(24∶1)，振荡混匀20 s，10000 g 离心5 min，取上清液。
8.5.5 加入两倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，10000 g离心10 min，弃上清。
8.5.6 室温干燥后，加入30 μL RNase-free水溶解沉淀，即得DNA模板，-20 ℃贮存备用。
8.5.7 可采用同等提取效果的其他方法或商品化病毒核酸提取试剂盒。
8.6 PCR扩增
T/CVMA 177—2024
4
取8.5步骤提取的病毒核酸，进行PCR扩增检测，PCR反应体系及反应参数见附录B.2和B.3。
8.7 扩增产物电泳检测
8.7.1 样品制备：分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物8 μL 与2 μL 5×上样缓冲液混合均匀，加入核酸凝胶样品孔，核酸凝胶配置见附录A.5。
8.7.2 加样：分别取10 μL DNA Marker、PCR扩增产物、阴、阳性对照扩增产物，加入凝胶孔。
8.7.3 电泳：5 V/cm 恒压下电泳30 min ，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。
8.8 有效原则
8.8.1 阳性对照：PCR产物有474 bp 的特异性核酸条带。
8.8.2 阴性对照：PCR产物无核酸条带。
8.8.3 8.8.1和8.8.2在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新检测。
8.9 结果判定
在实验有效的前提下，被检样品的PCR产物电泳后在474 bp位置出现特异性条带，判定为猫疱疹病毒核酸阳性，否则判定为阴性。
9 猫疱疹病毒荧光PCR检测
9.1 仪器
9.1.1 荧光定量PCR仪。
9.1.2 其他仪器设备同猫疱疹病毒的PCR检测设备。
9.2 引物探针和阳性对照
荧光PCR引物探针序列见附录C.1。
9.3 病毒DNA提取
方法同8.5。
9.4 荧光PCR操作步骤
9.4.1 荧光PCR扩增试剂的准备与配制
配备荧光PCR扩增试剂，根据被检样品数量，按照推荐的反应液配方（见附录C.2）配制反应液，充分混合均匀后分装，每个反应管15 μL。
9.4.2 加样
将9.4.1配好的反应管中分别加入9.3中制备的DNA核酸溶液2 μL（约500 ng），使每管总体积达到20 μL，阳性对照组加入1 μL制备的阳性对照质粒（见附录D），阴性对照组加入1 μL灭菌水，记录反应管对应的样品编号，盖紧管盖后，500 g离心30 s。
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5
9.4.3 荧光PCR反应设定
将9.4.2中加样后的反应管放入荧光定量PCR仪内，编辑样品表后，选定与探针标记荧光基团相符合的检测通道读取荧光信号值，淬灭基团选择none。推荐的荧光PCR反应参数见C.3。
9.4.4 结果判定
9.4.4.1 确定阈值
读取检测结果，阈值设定原则以大于样本荧光背景值，并超过阴性对照扩增曲线的最高值为标准，可根据不同仪器噪声进行调整。
9.4.4.2 质控标准
阴性对照无特异性扩增曲线，阳性对照为典型的“S”型扩增曲线，且Ct值≤30。
9.4.4.3 阳性
若被检样品在相应通道Ct值＜35且出现特异性扩增曲线，判定被检样品猫疱疹病毒核酸阳性。
9.4.4.4 阴性
若被检样品在相应通道无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品猫疱疹病毒核酸阴性。
9.4.4.5 可疑
被检样品在相应通道35≤Ct值≤38时，且出现特异性扩增曲线，建议对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct 值≤38，扩增曲线有明显起峰，则判为猫白血病病毒核酸阳性；无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品猫白血病病毒核酸阴性。
10 诊断结果判定
10.1 猫疱疹病毒感染疑似病例
出现6.1和6.2中的任一项，可怀疑猫疱疹病毒感染。
10.2 确诊感染猫疱疹病毒
出现6.1和6.2中的任一项，且经猫疱疹病毒PCR检测或猫疱疹病毒荧光PCR检测核酸阳性，可诊断猫疱疹病毒感染。
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附 录 A （资料性） 试剂配方
A.1 10% SDS
在45 mL 无菌蒸馏水溶解5 g SDS（电泳级），加热至60 ℃溶解，用盐酸调pH值至7.8，加无菌蒸馏水定容至50 mL。
A.2 蛋白酶K贮备液（20 mg/mL)
每升无菌蒸馏水中加入Tris 1.21 mg，EDTA 1.86 mg，SDS 5 g，用盐酸调pH值至7.8。取该溶液按每毫升加入20 mg蛋白酶K，充分溶解后分装。
A.3 5×TAE电泳缓冲液
称量Tris 24.2 g，Na2EDTA·2H2O 3.72 g于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入5.71 mL的冰乙酸，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TAE。
A.4 5×TBE电泳缓冲液
称量Tris 54.0 g，EDTA 2.9 mg于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL 无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入硼酸27.5 g，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TBE。
A.5 核酸凝胶制备
取1.0 g 琼脂糖加入100 mL 1×TAE中加热至沸腾，充分溶化后冷却至50 ℃左右，加入核酸染色剂10 μL，混匀后倒入胶槽制备凝胶，凝固后置入电泳槽，加入1×TBE 核酸电泳缓冲液。
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7
附 录 B （资料性） PCR引物序列、反应条件和参数
B.1 PCR引物序列
猫疱疹病毒PCR扩增引物序列见表B.1。
表B.1 猫疱疹病毒PCR扩增引物序列
引物名称
基因
引物序列 5’-3’
UL23_PCR_F
UL23
ATACTGTCCGCATTTACATAG
UL23_ PCR_R
CAACTAGATTTCCACCAGGA
注1：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC水溶解并稀释至终浓度10 μmol/L, -20℃保存备用。
注2：扩增目的片段长度474 bp，针对FHV UL25基因。
B.2 PCR检测反应体系
猫疱疹病毒PCR检测反应体系见表B.2。
表B.2 猫疱疹病毒PCR检测反应体系
B.3 PCR反应参数
猫疱疹病毒PCR反应参数见表B.3。
表B.3 猫疱疹病毒PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
95
3 min
1
95
10 s
35
55
30 s
72
30 s
72
5 min
1
试剂
终浓度（μmol/L）
体积（μL）
2×Taq酶
/
10
UL23_ PCR_F
0.5
0.5
UL23_ PCR_R
0.5
0.5
待检核酸
/
2
灭菌去离子水
/
7
总体积
/
20
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8
附 录 C （资料性） 荧光PCR检测引物、反应体系及反应参数
C.1 荧光PCR引物序列
猫疱疹病毒荧光PCR扩增引物序列见表C.1。
表C.1 猫疱疹病毒荧光PCR扩增引物序列
引物名称
序列（5’→ 3’）
UL23_F
ATTTGCCGCACCATACCT
UL23_R
GCGAGTGGGAAACAGACC
UL23_P
FAM - CTTTTACATTCCAGACTATCCACAATAACAGG - BHQ-2
C.2 荧光PCR检测反应体系
猫疱疹病毒荧光PCR检测反应体系见表C.2。
表C.2 猫疱疹病毒荧光PCR检测反应体系
名称
工作液终浓度（μmol/L）
加样体积（μL）
Premix Ex Taq缓冲液
1×
10
UL23_F
0.4
1
UL23_R
0.4
1
UL23_P
0.2
0.5
待检核酸
/
2
灭菌水
/
5.5
总体积
/
20
C.3 荧光PCR反应参数
猫疱疹病毒荧光PCR检测反应参数见表C.3。
表C.3 猫疱疹病毒荧光PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
95
2 min
1
95
10 s
40
54
30 s
1
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附 录 D （资料性） FHV阳性质粒制备 D.1 FHV阳性对照质粒序列（GenBank Accession No. MH070348.1）
5’-ATACTGTCCGCATTTACATAGATGGTGCCTATGGAATAGGTAAGAGTTTAACGGCGAAGTACCTGGTCAGAGCGGATGAAAATCGACCGGGATATACTTACTACTTCCCAGAACCAATGCTATACTGCGTAGTCTCTTTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGCCGTCCAGGACCGGAAACGACGTGGTGAATTATCAGCTGAAGATGCTGCCTATATCACCGCCCACTATCAAGCAAGATTTGCCGCACATACCTTCTTTTACATTCCAGACTATCCACAATAACAGGATATCAGAAAGTTGTATGTGAGGAACACCCCGACGTGACCCTAATCATAGATAGACACCCTCTCGCCTCTCTGGTCTGTTTCCCACTCCAAGATATTTTGTGGGTGATATGACTCTTGGGTCTGTACTTAGTCTAATGGCAACACTTCCACGAGAACCTCCTGGTGGAAATCTAGTTG-3＇
注：斜体加粗为PCR扩增引物，黑色粗体为荧光定量PCR扩增引物和探针。
D.2 阳性对照重组质粒的制备
FHV PCR和荧光PCR使用同一阳性质粒，按照D.1中的序列合成基因片段，并克隆至pMD19-T载体，再转化至DH5α感受态细胞，构建重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度（ng/μL）×10-9]/（DNA碱基数×660）），即为猫疱疹病毒阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，选取104拷贝/μL稀释度作为FHV PCR和荧光PCR的阳性对照。上一篇：T/CVMA 176-2024 猫支气管败血波氏菌感染诊断技术规范
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CCS B 41
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猫疱疹病毒感染诊断技术规范
Technical Specification for diagnosis of feline herpesvirus infection
2024 - 9 - 9发布2024 - 9 - 9实施
中国兽医协会 发布
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、上海基灵生物科技有限公司、东莞博盛生物科技有限公司、北京市动物疫病预防控制中心、北京动物园管理处、山东省动物疫病预防与控制中心、山东合润检测技术有限公司、上海市动物疫病预防控制中心、广州源博医药科技有限公司、天津农垦康嘉生态养殖有限公司。
本文件主要起草人：梁瑞英、梁琳、汤新明、丁家波、侯绍华、朱旭、王弋、刘昕、张启龙、贾婷、金红岩、刘存、刘砚涵、孙振、赵洪进、赖强。
T/CVMA 177—2024
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猫疱疹病毒感染诊断技术规范
1 范围
本文件规定了猫疱疹病毒感染的流行病学和临床症状的诊断依据，以及猫疱疹病毒PCR、荧光PCR实验室检测的技术要求和操作规范。
本文件适用于猫疱疹病毒感染的诊断。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
T/CVMA 42 猫疱疹病毒荧光定量PCR检测方法
T/CVMA 113 猫疱疹病毒1型微滴式数字PCR检测方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
FHV：猫疱疹病毒（Feline herpesvirus，FHV）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
SDS：十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate）
TAE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_乙酸_乙二胺四乙酸（Tris Acetate-EDTA buffer）
TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷_硼酸_乙二胺四乙酸（Tris-Borate-EDTA buffer）
5 诊断原则
猫疱疹病毒感染的诊断以病原学检测为主，结合流行病学史、临床症状进行综合分析，做出诊断。流行病学史和临床症状是FHV感染的重要诊断依据，病例确诊需严格的病原学检测依据。
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6 诊断依据
6.1 流行病学
6.1.1 患猫发病前不久接触过FHV病猫或者无症状感染猫或患病猫使用过的用具。
6.1.2 患猫发病前有过生活环境的改变，比如寄养、更换住处、运输、进入多猫环境或去过医院。
6.1.3 收容所、猫舍等群养猫中出现了群发性呼吸道疾病，尤其在新引进猫后，未注射疫苗的猫症状更严重。
6.1.4 流浪猫或户外活动的猫发生呼吸道疾病。
6.2 临床症状
6.2.1 患病猫出现精神不佳、食欲下降，具有发热症状的猫可出现精神沉郁、嗜睡和食欲不振等症状，部分猫精神或食欲无异常。
6.2.2 打喷嚏、眼鼻分泌物增多、结膜炎、流涎等症状至少出现一种。
6.2.3 少数病例出现咳嗽、口腔溃疡和肺炎中的一种或者一种以上的症状。
6.3 结果判断
患病猫出现6.1和6.2的任一项，可初步判定为猫疱疹病毒感染的临床疑似病例，需要进一步做实验室诊断。
7 样品采集、保存、运输及处理
7.1 样品采集
将无菌棉拭子用灭菌生理盐水充分浸润，采集眼、鼻和口拭子样本。眼部应采集结膜囊内黏膜分泌物；深入鼻腔内部贴壁采集鼻腔黏膜分泌物；口腔应尽量采集咽喉深处黏膜分泌物。将采集后拭子放入已装好病毒保存液的商品化样本收集管内（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液），折断手柄，随即密封即完成取样，编号并填写相应采样单，样品尽快送检，送检时添加冰袋保持低温。
7.2 样品保存及运输
用于病毒核酸检测的样品应尽快送检，可在24 h之内检测的样本可置于4 ℃保存，24 h内无法检测的样本于-70 ℃或以下保存，如无-70 ℃保存条件，可置于-20 ℃冰箱暂存。
7.3 样品处理
取7.1收集的眼、鼻、口拭子保存液，4 ℃，2000 g离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。
8 猫疱疹病毒的PCR检测
8.1 仪器
8.1.1 PCR扩增仪。
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8.1.2 高速台式冷冻离心机。
8.1.3 生物安全柜。
8.1.4 移液器。
8.1.5 电泳仪。
8.1.6 电泳槽。
8.1.7 紫外凝胶成像仪。
8.2 耗材
8.2.1 离心管（1.5 L、200 μL）。
8.2.2 移液器吸头（2.5 μL、10 μL、100 μL）。
8.3 试剂
8.3.1 试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T 6682中一级水的要求。
8.3.2 无水乙醇。
8.3.3 10%SDS：配方见附录A.1。
8.3.4 蛋白酶K贮备液：配方见附录A.2。
8.3.5 TAE电泳缓冲液：配方见附录A.3。
8.3.6 TBE电泳缓冲液：配方见附录A.4。
8.3.7 病毒核酸提取试剂盒。
8.4 引物
猫疱疹病毒PCR扩增引物序列见附录B.1。
8.5 猫疱疹病毒DNA提取
8.5.1 取200 μL 7.3处理的样品，加入25 μL 10% SDS和10 μL 的20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育2 h。
8.5.2 放置到室温，加入等量的饱和酚溶液500 μL，振荡混匀20 s，10000 g 离心5 min，取上清液。
8.5.3 加入等量的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，振荡混匀20 s，10000 g，离心5 min，取上清液。
8.5.4 再加入等量的氯仿：异戊醇(24∶1)，振荡混匀20 s，10000 g 离心5 min，取上清液。
8.5.5 加入两倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，10000 g离心10 min，弃上清。
8.5.6 室温干燥后，加入30 μL RNase-free水溶解沉淀，即得DNA模板，-20 ℃贮存备用。
8.5.7 可采用同等提取效果的其他方法或商品化病毒核酸提取试剂盒。
8.6 PCR扩增
T/CVMA 177—2024
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取8.5步骤提取的病毒核酸，进行PCR扩增检测，PCR反应体系及反应参数见附录B.2和B.3。
8.7 扩增产物电泳检测
8.7.1 样品制备：分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物8 μL 与2 μL 5×上样缓冲液混合均匀，加入核酸凝胶样品孔，核酸凝胶配置见附录A.5。
8.7.2 加样：分别取10 μL DNA Marker、PCR扩增产物、阴、阳性对照扩增产物，加入凝胶孔。
8.7.3 电泳：5 V/cm 恒压下电泳30 min ，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。
8.8 有效原则
8.8.1 阳性对照：PCR产物有474 bp 的特异性核酸条带。
8.8.2 阴性对照：PCR产物无核酸条带。
8.8.3 8.8.1和8.8.2在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新检测。
8.9 结果判定
在实验有效的前提下，被检样品的PCR产物电泳后在474 bp位置出现特异性条带，判定为猫疱疹病毒核酸阳性，否则判定为阴性。
9 猫疱疹病毒荧光PCR检测
9.1 仪器
9.1.1 荧光定量PCR仪。
9.1.2 其他仪器设备同猫疱疹病毒的PCR检测设备。
9.2 引物探针和阳性对照
荧光PCR引物探针序列见附录C.1。
9.3 病毒DNA提取
方法同8.5。
9.4 荧光PCR操作步骤
9.4.1 荧光PCR扩增试剂的准备与配制
配备荧光PCR扩增试剂，根据被检样品数量，按照推荐的反应液配方（见附录C.2）配制反应液，充分混合均匀后分装，每个反应管15 μL。
9.4.2 加样
将9.4.1配好的反应管中分别加入9.3中制备的DNA核酸溶液2 μL（约500 ng），使每管总体积达到20 μL，阳性对照组加入1 μL制备的阳性对照质粒（见附录D），阴性对照组加入1 μL灭菌水，记录反应管对应的样品编号，盖紧管盖后，500 g离心30 s。
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9.4.3 荧光PCR反应设定
将9.4.2中加样后的反应管放入荧光定量PCR仪内，编辑样品表后，选定与探针标记荧光基团相符合的检测通道读取荧光信号值，淬灭基团选择none。推荐的荧光PCR反应参数见C.3。
9.4.4 结果判定
9.4.4.1 确定阈值
读取检测结果，阈值设定原则以大于样本荧光背景值，并超过阴性对照扩增曲线的最高值为标准，可根据不同仪器噪声进行调整。
9.4.4.2 质控标准
阴性对照无特异性扩增曲线，阳性对照为典型的“S”型扩增曲线，且Ct值≤30。
9.4.4.3 阳性
若被检样品在相应通道Ct值＜35且出现特异性扩增曲线，判定被检样品猫疱疹病毒核酸阳性。
9.4.4.4 阴性
若被检样品在相应通道无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品猫疱疹病毒核酸阴性。
9.4.4.5 可疑
被检样品在相应通道35≤Ct值≤38时，且出现特异性扩增曲线，建议对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct 值≤38，扩增曲线有明显起峰，则判为猫白血病病毒核酸阳性；无Ct值或Ct值＞38，判定被检样品猫白血病病毒核酸阴性。
10 诊断结果判定
10.1 猫疱疹病毒感染疑似病例
出现6.1和6.2中的任一项，可怀疑猫疱疹病毒感染。
10.2 确诊感染猫疱疹病毒
出现6.1和6.2中的任一项，且经猫疱疹病毒PCR检测或猫疱疹病毒荧光PCR检测核酸阳性，可诊断猫疱疹病毒感染。
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附 录 A （资料性） 试剂配方
A.1 10% SDS
在45 mL 无菌蒸馏水溶解5 g SDS（电泳级），加热至60 ℃溶解，用盐酸调pH值至7.8，加无菌蒸馏水定容至50 mL。
A.2 蛋白酶K贮备液（20 mg/mL)
每升无菌蒸馏水中加入Tris 1.21 mg，EDTA 1.86 mg，SDS 5 g，用盐酸调pH值至7.8。取该溶液按每毫升加入20 mg蛋白酶K，充分溶解后分装。
A.3 5×TAE电泳缓冲液
称量Tris 24.2 g，Na2EDTA·2H2O 3.72 g于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入5.71 mL的冰乙酸，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TAE。
A.4 5×TBE电泳缓冲液
称量Tris 54.0 g，EDTA 2.9 mg于1 L烧杯中。向烧杯中加入约600 mL 无菌蒸馏水，充分搅拌溶解；加入硼酸27.5 g，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TBE。
A.5 核酸凝胶制备
取1.0 g 琼脂糖加入100 mL 1×TAE中加热至沸腾，充分溶化后冷却至50 ℃左右，加入核酸染色剂10 μL，混匀后倒入胶槽制备凝胶，凝固后置入电泳槽，加入1×TBE 核酸电泳缓冲液。
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附 录 B （资料性） PCR引物序列、反应条件和参数
B.1 PCR引物序列
猫疱疹病毒PCR扩增引物序列见表B.1。
表B.1 猫疱疹病毒PCR扩增引物序列
引物名称
基因
引物序列 5’-3’
UL23_PCR_F
UL23
ATACTGTCCGCATTTACATAG
UL23_ PCR_R
CAACTAGATTTCCACCAGGA
注1：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC水溶解并稀释至终浓度10 μmol/L, -20℃保存备用。
注2：扩增目的片段长度474 bp，针对FHV UL25基因。
B.2 PCR检测反应体系
猫疱疹病毒PCR检测反应体系见表B.2。
表B.2 猫疱疹病毒PCR检测反应体系
B.3 PCR反应参数
猫疱疹病毒PCR反应参数见表B.3。
表B.3 猫疱疹病毒PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
95
3 min
1
95
10 s
35
55
30 s
72
30 s
72
5 min
1
试剂
终浓度（μmol/L）
体积（μL）
2×Taq酶
/
10
UL23_ PCR_F
0.5
0.5
UL23_ PCR_R
0.5
0.5
待检核酸
/
2
灭菌去离子水
/
7
总体积
/
20
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附 录 C （资料性） 荧光PCR检测引物、反应体系及反应参数
C.1 荧光PCR引物序列
猫疱疹病毒荧光PCR扩增引物序列见表C.1。
表C.1 猫疱疹病毒荧光PCR扩增引物序列
引物名称
序列（5’→ 3’）
UL23_F
ATTTGCCGCACCATACCT
UL23_R
GCGAGTGGGAAACAGACC
UL23_P
FAM - CTTTTACATTCCAGACTATCCACAATAACAGG - BHQ-2
C.2 荧光PCR检测反应体系
猫疱疹病毒荧光PCR检测反应体系见表C.2。
表C.2 猫疱疹病毒荧光PCR检测反应体系
名称
工作液终浓度（μmol/L）
加样体积（μL）
Premix Ex Taq缓冲液
1×
10
UL23_F
0.4
1
UL23_R
0.4
1
UL23_P
0.2
0.5
待检核酸
/
2
灭菌水
/
5.5
总体积
/
20
C.3 荧光PCR反应参数
猫疱疹病毒荧光PCR检测反应参数见表C.3。
表C.3 猫疱疹病毒荧光PCR反应参数
反应温度 (℃)
反应时间
循环数
95
2 min
1
95
10 s
40
54
30 s
1
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附 录 D （资料性） FHV阳性质粒制备 D.1 FHV阳性对照质粒序列（GenBank Accession No. MH070348.1）
5’-ATACTGTCCGCATTTACATAGATGGTGCCTATGGAATAGGTAAGAGTTTAACGGCGAAGTACCTGGTCAGAGCGGATGAAAATCGACCGGGATATACTTACTACTTCCCAGAACCAATGCTATACTGCGTAGTCTCTTTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGCCGTCCAGGACCGGAAACGACGTGGTGAATTATCAGCTGAAGATGCTGCCTATATCACCGCCCACTATCAAGCAAGATTTGCCGCACATACCTTCTTTTACATTCCAGACTATCCACAATAACAGGATATCAGAAAGTTGTATGTGAGGAACACCCCGACGTGACCCTAATCATAGATAGACACCCTCTCGCCTCTCTGGTCTGTTTCCCACTCCAAGATATTTTGTGGGTGATATGACTCTTGGGTCTGTACTTAGTCTAATGGCAACACTTCCACGAGAACCTCCTGGTGGAAATCTAGTTG-3＇
注：斜体加粗为PCR扩增引物，黑色粗体为荧光定量PCR扩增引物和探针。
D.2 阳性对照重组质粒的制备
FHV PCR和荧光PCR使用同一阳性质粒，按照D.1中的序列合成基因片段，并克隆至pMD19-T载体，再转化至DH5α感受态细胞，构建重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度（ng/μL）×10-9]/（DNA碱基数×660）），即为猫疱疹病毒阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，选取104拷贝/μL稀释度作为FHV PCR和荧光PCR的阳性对照。