T/GAIA 031-2025 人血清中米酵菌酸的测定 高效液相色谱-串联质谱法

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​1. 核心信息​

• ​标题​：人血清中米酵菌酸（Bongkrekic acid）的测定方法
• ​检测技术​：超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）
• ​适用范围​：人血清中米酵菌酸的定量检测
• ​最低检测质量浓度​：​0.75 μg/L​（检出限）
• ​发布与实施日期​：2025年4月17日发布，2025年4月24日实施
• ​归口单位​：广东省分析测试协会
• ​起草单位​：广州市/深圳市/珠海市等疾控中心及仪器公司

​2. 方法原理​

• ​前处理​：
  • 血清样本经 ​0.1%氨水甲醇-乙腈溶液（80+20, v/v）​​ 提取，涡旋离心后取上清液。
  • ​正己烷净化去除脂质干扰，下层溶液过0.22 μm滤膜后进样。
• ​检测原理​：
  目标物经色谱分离后，采用电喷雾离子源（ESI⁻）负离子模式进行多反应监测（MRM），外标法定量。

​3. 关键试剂与材料​

• ​试剂​：
  • 乙腈、甲醇（色谱纯）、甲酸、氨水（25–28%）、正己烷。
• ​标准品​：
  • 米酵菌酸（C₂₈H₃₈O₇，CAS:11076-19-0），纯度≥95%。
• ​标准溶液配制​：
  • 储备液（10.0 mg/L，甲醇配制，-20℃保存6个月）；
  • 工作液（0.5–50.0 μg/L，临用现配）。

​4. 仪器条件​

​色谱条件​

• ​色谱柱​：C18柱（50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm）
• ​流动相​：
  • ​A相​：0.05%甲酸水溶液
  • ​B相​：甲醇
• ​梯度程序​：

  时间(min)	A(%)	B(%)
  0.0	70	30
  7.0	5	95
  7.1–9.0	70	30

• ​流速​：0.3 mL/min；柱温​：40℃；进样量​：5 μL。

​质谱条件​

• ​离子源​：ESI⁻
• ​监测离子对（MRM）​​：

  母离子 (m/z)	子离子 (m/z)	功能	去簇电压(V)	碰撞能量(eV)
  485.6	441.4	定量离子	-30	-16
  485.6	397.3	定性离子	-30	-25

• 辅助参数：喷雾电压（-4500 V）、雾化气压力（379.2 kPa）、气帘气压力（206.8 kPa）。

​5. 分析步骤​

1. ​样本处理​：
   • 取200 μL血清 + 1 mL提取液 → 涡旋2 min → 10,000 r/min离心5 min。
   • 取上清液 + 0.5 mL正己烷 → 涡旋脱脂 → 取下层过膜进样。
2. ​标准曲线​：
   • 浓度梯度：0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L。
   • 线性要求：相关系数 ​R² > 0.99。
3. ​定性确证​：
   • 保留时间偏差 ≤ ±2.5%；
   • 子离子相对丰度偏差符合表3要求（如>50%时允许±20%偏差）。
4. ​定量计算​：
   C=C0×V0VC = /frac{C_0 /times V_0}{V}C=VC0​×V0​​
   • CCC：血清中米酵菌酸浓度（μg/L）；
   • C0C_0C0​：由标准曲线得到的浓度（μg/L）；
   • V0V_0V0​：提取液体积（1 mL）；
   • VVV：血清取样体积（0.2 mL）。
   • ​结果保留三位有效数字。

​6. 方法验证​

• ​正确度（回收率）​​：
  添加浓度0.5–50.0 μg/L时，回收率 ​80.0%–120%​。
• ​重复性​：
  两次独立测定结果的绝对差值 ≤ 算术平均值的 ​10%​。

​7. 附录与支持文件​

• ​附录A​：米酵菌酸标准溶液（10.0 μg/L）的提取离子色谱图（图A.1）。
• ​引用标准​：
  • GB/T 6682（实验室用水规范）
  • GB/T 8170（数值修约规则）
  • GB/T 16126（生物监测质量保证）

​8. 样本采集与保存​

• ​采集​：非抗凝管采集 ≥2 mL静脉血，静置30 min后离心（3,000 r/min, 15 min）。
• ​保存​：上清液转移至离心管，按GB/T 16126要求运输保存。

​总结​

该方法通过氨水甲醇-乙腈提取和正己烷净化优化前处理，结合UHPLC-MS/MS负离子监测实现人血清中米酵菌酸的高灵敏度检测（检出限0.75 μg/L）。标准流程涵盖试剂配制、仪器参数、定性定量规则及方法验证指标，适用于疾控机构对米酵菌酸中毒事件的快速精准检测。