T/ZHCA 033-2024 化学品心脏毒性评价 人诱导多能干细胞衍生心肌细胞微电极阵列电生理检测法

团体标准《T/ZHCA 033-2024 化学品心脏毒性评价人诱导多能干细胞衍生心肌细胞微电极阵列电生理检测法》的详细内容总结：

​1. 标准核心目的​

建立基于人诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）​​ 结合微电极阵列（MEA）电生理检测的体外方法，用于评价化学品的心脏毒性风险，特别是复极失调（如QT间期延长）导致的尖端扭转型室速（TdP）和心脏猝死（SCD）风险。

​2. 核心术语定义​

• ​iPSC-CMs​（3.1）：
  人诱导多能干细胞定向分化的心肌细胞，需具备自主搏动、收缩、单细胞动作电位（AP）及多细胞场电位（FP）等电生理特性（纯度≥90%，成熟度≥30天）。
• ​MEA检测​（3.2）：
  通过集成电极阵列芯片实时监测多通道电生理信号。

​3. 试验原理​

• ​关键风险机制​：化学品可能干扰心肌复极过程，延长校正场电位时程（FPDcF），诱发心律失常。
• ​核心指标​：
  • ​FPDcF​（校正场电位时程）：使用Fridericia公式校正（FPDcF = FPD / (ISI)^(1/3)），作为主要毒性判据。
  • ​其他指标​：场电位幅度（FPA）、搏动周期（ISI）、心律失常事件（如早后除极EAD）。
• ​评价依据​：比较化合物在有效游离血药浓度（fETPC）​​ 范围内对上述指标的影响。

​4. 试剂与材料要求​

• ​细胞模型​：iPSC-CMs（需验证纯度与成熟度）。
• ​关键试剂​：
  • 培养基（含RPMI1640 + B27添加剂）、基质胶（Matrigel）、酶洗涤剂（Tergazyme）。
  • ​参比化合物​（验证平台可靠性）：
    • ​高风险化合物​：多菲利特、索他洛尔、E-4031、奎尼丁（诱发FPD延长）。
    • ​低风险化合物​：美西律、维拉帕米（不显著延长FPD）。
  • ​阴性对照​：DMSO（终浓度≤0.5%）。
• ​浓度范围​：参比物验证浓度见附录A（如多菲利特0.0003–0.01 μmol/L）。

​5. 仪器设备​

• ​核心设备​：
  • MEA检测系统（采样频率≥5 kHz，六孔电极板）。
  • 细胞培养设备（CO₂培养箱、倒置显微镜、生物安全柜）。
• ​辅助设备​：离心机、移液器、细胞计数仪等。

​6. 试验步骤​

​​（1）MEA电极板准备​

• ​清洗​：酶洗涤剂浸泡24h → 75%乙醇消毒 → 无菌水冲洗。
• ​包被​：冰上稀释基质胶，电极区域加10μL，37°C固化1h。

​​（2）细胞接种与培养​

• ​细胞处理​：胰酶消化iPSC-CMs → 离心重悬 → 计数至密度1×10⁷/mL。
• ​接种​：10μL细胞悬液加入电极区，静置5min → 37°C培养1h → 补足0.5mL培养基 → 每48h换液。
• ​试验窗口​：接种后第8–12天进行检测。

​​（3）测试流程​

• ​急性试验​：
  • 化合物暴露20min，记录1–2min稳定信号。
  • 检测浓度需覆盖fETPC范围，DMSO终浓度≤0.5%。
• ​慢性试验​（急性阴性时启用）：
  • 暴露后24h/48h监测信号，每次20min。
• ​平行要求​：每浓度重复3–4次（n=3–4），无需复孔。

​7. 数据记录与分析​

• ​基线要求​：
  • FPA ≥ ±200 μV、T波振幅≥20 μV、ISI 750–1500 ms、FPD 320–450 ms。
• ​校正公式​：FPDcF = FPD / (ISI)^(1/3)。
• ​统计方法​：独立样本t检验（p<0.05为显著差异）。

​8. 结果判定​

• ​试验成立条件​：
  阴性对照（0.5% DMSO）对FPDcF的影响≤10%。
• ​毒性风险分级​：

  ​FPDcF变化​	​浓度倍数​	​判定结果​	​风险等级​
  延长<10%	最大浓度/fETPC >10倍	阴性	低风险（无显著毒性）
  延长≥30%（p<0.05）	检测浓度/fETPC <10倍	阳性	高风险
  诱发EAD（早后除极）	任意浓度	阳性	高风险

​9. 试验报告内容​

必须包括：

• 试验依据、细胞来源与培养信息。
• 化合物详情（名称、浓度、配制方法）。
• 试验条件、具体步骤、结果与结论。
• 试验日期、人员签字/单位签章。

​10. 附录A（参比化合物表）​​

​关键创新点​

• ​技术结合​：利用iPSC-CMs模拟人体心肌电生理特性，通过MEA实现高灵敏度多通道检测。
• ​核心指标​：以FPDcF​（校正场电位时程）替代传统QT间期，提升毒性预测准确性。
• ​分层评价​：急性/慢性试验结合，覆盖不同作用机制的化合物风险。

此标准为化学品心脏毒性提供标准化、可重复的体外评价方案，适用于药物研发、化妆品及化工产品安全性评估。